牛沁雅，孟令缘，张艳，李珊珊，施春雷，史贤明，杨保伟

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.富平县检验检测中心（陕西省羊乳产品质量监督检验中心），陕西富平711700；3.上海交通大学农业与生物学院，上海200240)

0 引 言

阪崎克罗诺杆菌（C ronobacter sakazakii,C.Sakazakii），是一种无芽孢的革兰氏阴性杆菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症和肠炎。据报道，阪崎克罗诺杆菌感染早产婴儿造成的死亡率可达到40%～80%[1-9]。虽然前期研究已在婴幼儿配方乳粉、饮料、奶酪、鸡蛋、鱼、禽肉、虾、米饭、饺子、婴幼儿食品辅料和一些零售食品等中间检出阪崎克罗诺杆菌，但婴幼儿配方乳粉（Pow dered In fant Form u la,PIF）被认为是该菌最主要、最常见的传播源及载体[10-17]。

生产过程中PIF可能会被阪崎克罗诺杆菌污染，但细胞数一般较少。同时由于PIF中水分活度很低，阪崎克罗诺杆菌即使存在也无法生长繁殖。然而，冲调的复溶配方乳粉（R econstituted Pow dered In fant Form ula,RPIF）却是该菌生长繁殖的良好营养基质。日常生活中，很多情况下婴幼儿不能一次性进食完冲调的RPIF，在一些婴幼儿护理中心、医院甚至家庭中，医护人员无法做到及时清洗奶瓶，若奶瓶贮藏温度不适，原本存在于PIF中的少量阪崎克罗诺杆菌则可能在RPIF中快速生长繁殖，从而交叉污染或直接污染再次冲调的RPIF，导致食源性疾病爆发[18-21]。

阪崎克罗诺杆菌在RPIF中的迟滞期、剩余RPIF或奶瓶的储藏温度、污染菌的细胞数量是影响其在RPIF中生长繁殖的决定性因素[22]。为防止食用受到阪崎克罗诺杆菌污染的RPIF，本研究探讨了几个关键的培养参数对4、15、25、37℃（分别代表剩余RPIF和奶瓶在冰箱及不同季节室温储存的温度）下RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长的影响，预测阪崎克罗诺杆菌在RPIF中的生长规律，以便为有效减少医院及家庭环境中相关病原菌的污染风险提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株C ronobacter sakazakii ATCC BAA 894，由中国食品药品检定研究院提供，用于生长曲线测定以及初级、二级模型建立。

1.1.2 试剂

Luria-Bertani Agar（LB）和 Brian Heart In fusion（BH I）培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；婴幼儿配方乳粉由市场购买生产日期为同批次的某品牌金装幼儿配方粉。

1.1.3 仪器与设备

LAC-5080S高压灭菌锅，上海博讯；SW-CJ-1CU超净工作台，苏州泰安；NU-425-400E生物安全柜，美国；微量移液枪，德国Effendorf；MIR-253-20℃超低温冰箱，日本三洋；MDF-3286S-80℃超低温冰箱，日本三洋；Q L-86旋涡振荡器，其林贝尔；GNP-9080隔水式恒温培养箱，上海精宏；XS204百分之一天平，梅特勒；78-1磁力搅拌器，常州国华；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴箱，天津泰斯特；BCD-205TA 4℃冰箱，青岛海尔；ZHWY-211B摇恒温培养振荡器，上海智诚；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养与菌落计数

将-80℃保存的菌液划线于LB平板，37℃培养18～24 h，挑取一单菌落接种于200 m L BH I肉汤培养基，37℃、100 r/min摇床培养18～24 h。

通过菌落计数法确定BH I培养基中阪崎克罗诺杆菌的初始浓度[23]。吸取1 m L的BH I培养物加入9 m L的生理盐水中进行10倍梯度稀释，选择2～3个适宜的稀释度，取1 m L稀释液涂布于LB平板，每个稀释度设3个平行，37℃培养24 h，选取菌落数在30～300之间、无蔓延菌落生长的平板计数，最终浓度以每毫升菌液的菌落形成单位（Co lony Forming Unit,CFU）平均值表示。

1.2.2 RPIF制备

根据奶粉外包装袋上的使用说明冲调乳粉溶液。称取30 g乳粉于120 m L灭菌水中，搅拌直至完全溶解。复溶乳粉分装至50 m L离心管中，每管10m L，121℃灭菌20 min，冷却备用。

1.2.3 阪崎克罗诺杆菌生长曲线测定

将0.1 m L菌液接入分装好的无菌RPIF中，接种菌液的终浓度控制在103～104CFU/m L。RPIF分别置于4、15、25、37℃条件下培养，测定不同培养时间下阪崎克罗诺杆菌的活菌数。以培养时间为横坐标，活细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.4 初级模型建立

选取Gom pertz方程和Logistic方程2种初级模型预测菌株生长规律。

Gom pertz方程为公式（1）

该方程用于计算阪崎克罗诺杆菌在测试温度下的迟滞时间λ（h），最大生长速率μm（h-1），培养时间无限增加时细菌数量的增量（A）[24-25]。

Logistic方程为公式（2）：

式中，C为活菌总数（CFU/m L），Cmax为最大活菌总数。

1.2.5 二级模型建立

根据细胞活菌数量化温度对生长速率及迟滞时间的影响，模拟构建生长模型。以修正的Gom pertz方程作为主要生长模型，得出与生长相关关键参数[24]。二次模型构建时，用R atkow sky平方根模型[26]和二次R osso模型[27]评估不同温度下阪崎克罗诺杆菌的最大生长速率。使用R atkow sky模型和双曲线方程反算结果的对数与迟滞期的数据进行拟合[28]。

为了评估贮藏温度对RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长的影响，研究采用平方根模型拟合温度与最大生长速率μmax，使用预测值和试验值之间的残差以及比较用的温度预测模型进行验证。

1.2.6 数据分析

采用Curve Expert1.4软件对生长曲线进行分析，利用Microsoft excel 2010建立二级预测模型，采用平方根模型拟合菌株最大生长速率μmax，评价贮藏温度对RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长的影响。

2 结 果

2.1 RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长曲线

阪崎克罗诺杆菌ATCC BAA894在RPIF中4℃培养72 h后的生长曲线不符合S型，见图1a，表1。在15、25、37℃下培养后，采用Gom pertz、Logistic模型进行拟合，见表1，表2。各拟合方程的标准差和相关系数表明，与Logistic模型相比，Gom pertz方程拟合的一级生长模型较好。

图1 不同温度下阪崎克罗诺杆菌的生长曲线

表1 RPIF中阪崎克罗诺杆菌在4、15、25、37℃下的生长 log(CFU·m L-1)

表2 RPIF中阪崎克罗诺杆菌在15、25、37℃下的参数及Gompertz模型

Gom pertz模型显示，在15、25、37℃培养时，RPIF中阪崎克罗诺杆菌的生长规律遵循单细胞微生物典型的S型生长曲线，见图1b、c、d。在一定培养温度范围内，温度越高，阪崎克罗诺杆菌生长繁殖越快，到达最大生长速率所需时间t1、到达稳定期所需时间t2及迟滞时间λ越短，最大生长速率μm越高，见表3。

2.2 温度对RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长的影响

绘制R atkow sky平方根模型可反应最大生长速率的平方根与温度间的关系。其形式为：b(T-Tmin)，b为系数，Tmin为理论最低生长温度，即回归线延长线与温度轴相交所得的温度。结果表明，温度升高，最大生长速率的平方根同步增加，见图2。最优拟合的二级模型中的参数见表4，具体方程如下：

对阪崎克罗诺杆菌生长速率模型的准确性验证后，残差检验结果表明RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长速率残差均在±0.05之间，即预测模型在α=0.05水平可信，见图3。实测值与预测值对比检验结果表明，阪崎克罗诺杆菌生长速率实测值与预测值较为接近，预测结果可靠，见图4。使用准确性因子与偏差性因子对预测值和实测值分析后，所得偏差性因子的值为1.0096，准确性因子的值为0.9905，均符合模型可接受条件的要求，即该模型可较好反映冲调奶粉中阪崎肠杆菌在不同温度下生长速率的高低，见表5。研究获得的方程式可以用来预测RPIF中阪崎克罗诺杆菌的生长，以避免食用PIF的感染风险。

表3 RPIF中阪崎克罗诺杆菌在15、25、37℃下Gompertz模型参数

图2 温度对RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长影响的平方根模型

表4 RPIF中阪崎克罗诺杆菌的平方根模型参数

图3 RPIF中阪崎克罗诺杆菌生长速率残差

图4 RPIF中阪崎克罗诺杆菌在15、25、37℃下生长速率的实际值与预测值比较

表5 阪崎克罗诺杆菌生长速率实测值与预测值分析

3 讨 论

RPIF是阪崎克罗诺杆菌生长的良好物质，因此应在PIF加工和食用过程中严格控制和预防该致病菌[2,29]。日常生活中，有些婴幼儿在饮用RPIF时并不能一次性饮用完，家长可能会将其放置于4℃冰箱或室温保存，以供婴幼儿再次饮用。还有些情况下，婴幼儿饮用完毕的奶瓶并没有及时清洗，而是放置于室温，这刚好是PIF中可能存在的少量阪崎克罗诺杆菌大量生长繁殖的良好条件，结果导致严重的食品安全问题。本研究探讨了RPIF中阪崎克罗诺杆菌在4、15、25、37℃下的生长情况，以此模拟RPIF或奶瓶贮存于冰箱及室温的环境温度，预测、评估未饮用完的RPIF和未立即清洗的空奶瓶的安全性。

阪崎克罗诺杆菌在RPIF中生长一级模型的建立一定程度反映了该菌的生长规律。Fakruddin等[30]采用Gom pertz模型对10.0～40.0℃下RPIF中阪崎克罗诺杆菌的生长进行拟合，经评价后发现Gom pertz模型拟合效果好，适合描述不同温度下阪崎克罗诺杆菌的生长。邱红玲[31]等研究者也指出修正的Gom pertz能较好地拟合复原乳中3种致病菌在4～42℃或者25～42℃条件下的生长动力学参数。与以上研究结果相似，本研究显示采用Gom pertz、Logistic模型进行拟合，各拟合方程的标准差和相关系数表明Gom pertz方程拟合的一级生长模型更好。

RPIF中的阪崎克罗诺杆菌开始生长的迟滞期长短不仅取决于环境，还取决于其处于何种生长阶段[32]。根据对生长数据的统计学分析，我们发现，虽然在RPIF中接种稳定期的阪崎克罗诺杆菌，但15、25、37℃下其生长曲线均呈现S型且迟滞期较短。Kandhai等研究者对RPIF中不同生长阶段的阪崎克罗诺杆菌的生长曲线进行Gom pertz模型拟合，研究表明预培养条件不会影响RPIF中阪崎克罗诺杆菌的生长速率或迟滞期，并且迟滞期通常很短[33]。另一研究显示，尽管在10℃储藏RPIF可以观察到明显的迟滞期，但升高温度至25、37、45℃并不能观察到明显的迟滞期[34]。与预培养时间和温度对生长速率和迟滞期的影响相似，其他结果表明，接种量（即高或低接种量）和RPIF组成对阪崎克罗诺杆菌的生长也没有影响[2]，这可能由于RPIF营养丰富，阪崎克罗诺杆菌较短时间可内适应生长环境。以上结果表明，如果未正确保存剩余的RPIF或未及时清洗奶瓶，将有可能感染阪崎克罗诺杆菌，并对婴幼儿构成巨大的潜在危害。

温度是影响RPIF中阪崎克罗诺杆菌的生长的因素之一。本研究通过建立二级模型并对阪崎克罗诺杆菌的生长速率和相关参数进行了残差检验、实测值与预测值对比检验以及准确性因子与偏差性因子检验，其中准确性因子可用于衡量预测值和实测值之间的接近程度，越接近1表示模型准确性越高，Braun等[35]认为准确性因子值在1.1～1.9之间，模型均可接受。G iffel等[36]认为偏差性因子值在0.75～1.25之间，模型可被接受，R oss等[37]认为偏差性因子值在0.9～1.05之间，模型可靠性较高。研究结果表明二级模型预测结果可靠，随着温度升高，RPIF中的阪崎克罗诺杆菌最大生长速率也会增加。Fang等通过生长动力学模型的建立及比较发现，在RPIF中，未经热处理的菌株生长温度范围为6.5～51.4℃，热处理菌株的生长温度范围为6.9～50.1℃，未经热处理和热损伤的菌株的生长速率无显著差异[38]。Kandhai等研究发现57株阪崎克罗诺杆菌中有50株在47℃下可以生长，但在4℃下均无生长，脑心浸肉汤（BH I）中阪崎克罗诺杆菌的最低生长温度为5.5～8℃[33,39]。与早期研究结果相似，本研究发现RPIF中阪崎克罗诺杆菌在4℃下可存活72 h且菌量稳定，这一温度相当于部分地区冬季的室外温度，也相当于冰箱储存温度。结果显示，如果剩余RPIF储存在冰箱或更低温度下，不会被阪崎克罗诺杆菌或低浓度阪崎克罗诺杆菌污染，无法造成感染，则剩余的RPIF仍可以饮用。

阪崎肠杆菌是一种条件性致病菌，对特殊人群的致死率甚至高达40%～80%。2003年Pagotto等首次研究指出，腹腔注射阪崎克罗诺杆菌剂量为×108CFU/m L的RPIF时，对乳鼠具有致死作用[40]。2012年徐桂香等研究表明，将×108CFU/m L的野生阪崎克罗诺杆菌腹腔注射出生三日的SD乳鼠，平均致死时间为6.5 h，且记录了不同注射剂量实验动物组死亡情况，结果显示野生阪崎克罗诺杆菌的半致死剂量为3.162×106CFU[41]。由于关于阪崎克罗诺杆菌对人致病的安全限量和相关毒力因子的信息有限，因此，所有的阪崎克罗诺杆菌都被视为潜在的病原体。本研究的结果可以预测4个季节不同温度下，阪崎克罗诺杆菌RPIF中的生长情况，有助于建立有效的食品安全控制措施。