中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响

2021-03-08丁茜赵凯茜王跃进

中国农业科学 2021年2期

丁茜，赵凯茜，王跃进

丁茜，赵凯茜，王跃进

西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业农村部西北地区园艺作物生物与种质创制重点实验室，陕西杨凌 712100

【】克隆中国野生毛葡萄（）‘丹凤-2’芪合酶（stilbene synthase）基因（）并研究其功能，为提高欧洲葡萄（）的白粉病抗性及品质提供依据。利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因构建植物过表达载体；用无核白单芽茎段诱导出分生愈伤组织，作为农杆菌介导法遗传转化的受体材料，获得抗性植株，经过不同水平检测，确定转基因植株；对野生型和转基因植株叶片人工接种葡萄白粉病菌（），通过显微技术观察叶片受白粉病菌侵染后的情况，比较两者对白粉病的抗性；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析野生型和转基因植株在自然条件和接种白粉病菌后及其相关基因的表达，用高效液相色谱法（HPLC）检测转基因植株中芪类物质的种类与含量。同源序列克隆得到（JQ868689）与（JQ868677）的cDNA序列，长度为1 179 bp。经PCR和Western blot检测，鉴定出过表达无核白植株4株和过表达无核白植株3株。显微观察发现，与野生型植株相比，转和植株叶片上的菌丝生长较慢，表现出对白粉病的抗性。qRT-PCR结果表明，自然生长条件下，与野生型植株相比，转和植株的表达量提高，上游苯丙氨酸裂解酶基因（）、下游白藜芦醇糖基转移酶基因（）、转录因子基因（、）的表达量均不同程度上升，而查尔酮合成酶基因（）表达量降低；人工接种白粉病菌后，与野生型植株相比，转基因植株表达量显著上调。高效液相色谱分析表明，自然条件下，芪类物质主要以反式云杉新苷形式存在，转基因植株芪类物质的含量高于野生型植株；在接种白粉病菌诱导表达后，除了反式云杉新苷，还产生了反式白藜芦醇和葡萄素，即转基因植株体内芪类物质的种类和含量均有所增加。将、转入无核白后，转基因植株的表达量增高，芪类物质的含量与种类增加，并抑制白粉病菌的生长。因此，中国野生毛葡萄‘丹凤-2’携带的和能够增强欧洲葡萄对白粉病的抗性，‘丹凤-2’可用作葡萄抗病性育种的种质资源。

中国野生毛葡萄；芪合酶基因；白藜芦醇；白粉病；遗传转化；抗病性

0 引言

【研究意义】葡萄是世界各地广泛栽培的果树[1]。据世界粮农组织（FAO）2017年数据统计（http:// www.fao.org/home/zh/），全球葡萄种植面积和总产量分别为693.14万公顷、7 427.66万吨。目前，葡萄生产中主栽品种为欧洲葡萄（），但该品种抗病能力差，易感白粉病[2]，病菌侵染对葡萄产量和质量造成巨大影响[3]。生产上常用化学药剂防治真菌病害，而杀菌剂的使用会增加生产成本，降低果实品质，长期使用还会影响环境[4]。因此，抗病育种是葡萄育种的主要目标之一[5]。利用转基因技术抗病育种，能够避免常规杂交育种出现的杂交不亲和及周期长的缺点。抗病育种需要有抗病种质资源，中国野生毛葡萄‘丹凤-2’（accession Danfeng-2）不仅抗病性强，并且白藜芦醇（resveratrol）含量高[6]。因此，将‘丹凤-2’中的抗病基因转入欧洲葡萄，提高其抗病性，获得抗病且白藜芦醇含量高的新品种，具有重要的理论和实践意义。【前人研究进展】研究表明，葡萄中的白藜芦醇是其特有的一种植保素[7]，不仅可以增强植物抗病性[8]，而且果实中的白藜芦醇对人体有抗氧化、抗衰老以及抗癌等作用[9-11]。芪合酶（stilbene synthase，STS）是白藜芦醇代谢途径的关键酶。因此，将芪合酶基因（）作为提高植物抗病性的目的基因，在葡萄[12]以及其他物种如猕猴桃[13]、苹果[14]、拟南芥[15]、水稻[16]、白杨[17]、苜蓿[18]等进行遗传转化，研究证明转入外源的过表达植株对逆境胁迫的抗性增强并且芪类物质积累。笔者所在课题组前期利用转基因技术，获得了过表达的无核白和霞多丽植株[19]、过表达、、、和的无核白植株，人工接种葡萄白粉病菌（）后发现，转基因植株芪类物质含量和种类增加，并且对白粉病的抗性也有所增强[12,20-21]。【本研究切入点】以中国野生毛葡萄‘丹凤-2’在成熟果实中表达较高的和在幼叶中表达较高的为目的基因，构建植物过表达载体，用农杆菌介导法转入欧洲葡萄无核白（cv. Thompson Seedless），研究基因表达特性以及抗病功能。【拟解决的关键问题】以无核白的分生愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法获得过表达、的无核白植株，比较过表达植株在接菌前后表达水平及芪类物质含量和种类的差异，研究的表达特性以及抗病功能，为葡萄抗病育种提供参考。

1 材料与方法

试验于2017—2019年在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室完成。

1.1 试验材料

中国野生毛葡萄‘丹凤-2’和欧洲葡萄无核白均定植于西北农林科技大学葡萄种质资源圃，试验所用葡萄白粉病菌取自此资源圃。在西北农林科技大学旱区逆境生物学国家重点实验室组培室培养无核白组培苗和分生愈伤组织。

1.2 VqSTS9与VqSTS21的生物信息学分析

在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）分别下载（GenBank登录号：JQ868689）、（GenBank登录号：JQ868677）基因序列，用DNAMAN V6软件比对序列与测序结果，以此来确定序列；、的基因染色体定位信息登录欧洲葡萄基因组网（http://www.genoscope.cns.fr/externe/ Genome Browser/Vitis/）获得；使用MEGA 6软件聚类分析、与其他物种的氨基酸序列。

1.3 VqSTS9和VqSTS21克隆与表达载体构建

提取中国野生毛葡萄‘丹凤-2’叶片的总RNA，参考E.Z.N.A Plant RNA kit（Omega）试剂盒说明书进行。将RNA反转录合成cDNA，此过程参照FastKing RT Kit（With gDNase）试剂盒（天根KR116）说明书进行。以cDNA为模板，设计扩增基因的引物（表1），分别在引物5′和3′端添加H I和I酶切位点序列，利用同源序列克隆和，将目标条带大小正确的产物回收，产物连接pGEM-T-easy载体，转入大肠杆菌T0P10感受态细胞中，培养至长出菌斑，挑取单克隆菌斑，菌液PCR检测，阳性菌液送至奥科生物有限公司测序。用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I（Omega）质粒提取试剂盒提取测序结果正确的菌液中的重组质粒，重组质粒和植物表达载体pCAMBIA2300分别用HI/I双酶切，将酶切后的目的基因与表达载体连接，转入农杆菌（）GV3101中，构建植物表达载体pCAMBIA35S::::。

表1 本研究所用引物

1.4 无核白葡萄的遗传转化

用无核白组培苗的单芽茎段，在培养基上诱导出用于遗传转化受体材料的分生愈伤组织，遗传转化用农杆菌介导法。转化的具体步骤：恒温摇床上二次活化农杆菌菌液（180 r/min，28℃），活化好的菌液，室温下5 500 r/min离心10 min，去上清，菌液重悬液（1/2 MS+20 g·L-1蔗糖，200 µmol·L-1乙酰丁香酮）重悬两次，180 r/min，28℃恒温培养2 h，转化用的菌液浓度OD600=0.7—1.0。将培养好的分生愈伤组织切小块，用活化好的适宜浓度的菌液侵染20 min，置于共培养培养基（IM3+200 µmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.8）上暗培养48 h，之后，用脱菌液（1/2 MS+20 g·L-1蔗糖+200 mg·L-1Carb）洗脱10 min，重复两次，再用无菌水4—5次，置于筛选培养基（IM3+300 mg·L-1Cef+75 mg·L-1Kan+200 mg·L-1Carb，pH 5.8）光培养，每个月切去褐化组织并且更换培养基一次，之后将愈伤组织转移至诱导分化培养基上促进分化长芽，将长至2—5 cm的芽置于生根培养基中进行生根成苗培养，方法参考文献[22]。

1.5 转基因植株的鉴定

通过PCR、Western blot对抗性植株进行检测鉴定，两种检测结果均为阳性的抗性苗确定其为转基因植株，对其进行扩繁、炼苗移栽。检测方法步骤：提取转基因植株叶片DNA（CTAB法），进行PCR检测，引物如表1所示。Western blot检测，先提取转基因植株叶片的蛋白质，提取方法：取叶片约0.5 g，在液氮中研磨成粉末，装于2.0 mL离心管中，加入250 μL蛋白裂解液，混匀，置冰上15 min，离心20 min，吸取上清，加入上样缓冲液，混匀，沸水中煮5 min，冷却至室温后，离心3 min，待用。参考HEART SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书制备SDS-PAGE胶，将提取好的蛋白质点样跑胶；将带有蛋白的胶切下用半干转膜法将蛋白胶中的蛋白转至PVDF膜上；用一抗杂交目的蛋白，二抗放大目的蛋白的信号，用带标签鼠单克隆抗体作为一抗，用HRP-羊抗小鼠IgG（H+L）作为二抗；二抗孵育结束后，洗掉膜表面的抗体，膜上加显色液，用BIO RAD Universal Hood II成像。

1.6 芪合酶代谢相关基因的表达分析

通过qRT-PCR分析过表达植株中以及其代谢相关基因的表达，分别包括与、。qRT-PCR的模板为转基因植株叶片的cDNA，提取方法参照1.3，、1定量引物设计参考Shi等[23]，其余5个基因定量引物设计参照Cheng等[12]，内参基因为，反应体系参考NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus说明书，用三步法进行qRT-PCR分析，3次生物学重复，每个生物学重复进行3次技术重复。

1.7 转基因植株抗病性分析

1.7.1 人工接种白粉病菌用压片法[24]对生长状态良好的转基因和野生型（wild type，WT）植株接种白粉病菌。操作方法：选生长状态良好的叶片进行接种，首先给叶片表面喷无菌水，然后将有白粉病菌的葡萄叶片在待接种叶片表面上覆盖轻轻摩擦完成接种。

1.7.2 白粉病菌侵染过程观察剪取白粉病菌侵染的叶片置于离心管中，加入台盼兰染液，使叶片完全浸泡在染液中，沸水中煮15 min，室温冷却后，倒掉染液，加入水合氯醛溶液浸泡清洗，至叶片无明显蓝色，在显微镜下观察记录白粉病菌的生长情况。

1.7.3 qRT-PCR分析接菌前后植株表达在接菌后0、1、2、3、4、5、6、7 d分别取野生型和转基因植株的接菌叶片，提取cDNA，进行qRT-PCR分析，方法参照1.6。

1.7.4 高效液相色谱法（HPLC）分析对接菌0 d和7 d的野生型和转基因植株叶片，用HPLC检测接菌前后植株中芪类物质的种类及含量。样品中的目标物质通过标准曲线上的保留时间来确定，含量通过标准峰面积和样品峰面积的比值来计算，方法参照ZHOU等[25]。

1.8 VqSTS9、VqSTS21在接种白粉病菌后的表达分析

通过压片法[24]对中国野生毛葡萄‘丹凤-2’叶片接种白粉病菌，以无菌水作为对照，在处理后0、12、24、48、72、96、120和144 h取样，进行qRT-PCR分析，方法参照1.6。

1.9 数据统计与分析

原始数据采用Microsoft Excel计算，数值均表示为“平均值±标准误”，采用origin8.0软件作图，通过spss软件one-way ANOVA（Tukey test）分析检验差异结果（*＜0.05，**＜0.01）。

2 结果

2.1 VqSTS9、VqSTS21在白粉病菌诱导条件下的表达

、均可以响应白粉病菌的诱导表达，在接菌后12 h表达量达到最高峰，与未接菌叶片相比，相对表达量分别提高了17与12倍。之后下降，120 h表达量再次上调，之后又有所下降。两个基因的表达模式相似，但表达水平不同，在接种12 h相对表达量高于（图1）。

2.2 VqSTS9、VqSTS21 序列分析

利用同源序列法克隆得到和基因序列（图2-A），经序列分析，可得出、CDS序列长度为 1 179 bp，蛋白质分子量为43 kD，编码392个氨基酸。以欧洲葡萄‘PN40024’（cv. Pinot Noir）基因组数据为参考依据，对、进行染色体定位分析（图2-B）和氨基酸序列比对分析（图2-C）。分析得出反向定位于16号染色体16 710 284—16 711 818位置，对应欧洲葡萄，与的氨基酸有4个位点不同。反向定位于16号染色体16 491 600—16 493 131位置，对应欧洲葡萄，与无氨基酸位点的差异。通过聚类分析不同植物的（图2-D），发现与最相似，相似度为98.72%；与最相似，相似度为100%，其次是与不同物种的高粱（），相似度分别为73.26%、73.78%。

图1 VqSTS9（A）、VqSTS21（B）在白粉病菌诱导下的表达

2.3 VqSTS9、VqSTS21克隆及表达载体的构建

利用同源序列法从中国野生毛葡萄‘丹凤-2’克隆得到、，构建用于本次遗传转化的植物过表达载体pCAMBIA35S::::、pCAMBIA35S::::（图3-A）。HΙ/Ι双酶切目的基因与表达载体的重组质粒（图3-B），将重组质粒转入农杆菌 GV3101中，菌液PCR检测（图3-C）。

2.4 欧洲葡萄无核白遗传转化及抗性植株检测

2.4.1 遗传转化取野生型（WT）无核白组培苗的单芽茎段，在培养基上诱导分生愈伤组织，用此愈伤组织作为转基因的受体材料。将目的基因通过农杆菌介导法转入愈伤组织中，通过再生途径，诱导愈伤组织分化出抗性芽，并通过生根培养长成抗性植株。其过程如下（图4-A）：生长状态良好的愈伤组织（a）；将其切块，用活化好的农杆菌侵染15—20 min，期间不断摇晃使其与菌液充分接触，随后倒掉菌液，多余的菌液用滤纸吸去，愈伤组织放入共培养培养基（b）中，培养48 h；共培养结束后，脱菌，放入筛选培养基中（c），每20—25 d继代一次，切除褐色部分，保留绿色部分继续进行培养，培养50—60 d后（d），放入筛选诱导分化培养基中，诱导愈伤组织长出抗性芽（e）；将抗性芽切下放入生根培养基中诱导生根（f）；生根的抗性芽继续在培养基中长大成苗（g）；抗性苗检测结果为阳性的，剪取单芽茎段大量扩繁（h），长至成苗（i），练苗移栽（j）。

2.4.2 抗性植株检测遗传转化共获得无核白抗性植株419株，转的抗性植株分别有223和196株。用PCR检测外源、内源和Western blot检测融合蛋白在植株中的表达（图4-B）。两种水平的检测结果均为阳性的植株有7株，过表达的无核白植株分别有4和3株，转化的阳性率分别为1.79%、1.53%。

2.5 转基因植株芪合酶代谢相关基因的表达分析

和分别在转基因株系中表达上调，其中OE-L2和OE-L2表达量最高，分别是野生型的5.6、12.3倍；表达上调，其中OE-L3和OE-L1表达量最高，分别是野生型的4.3、25.0倍；表达显著上调，其中OE-L2表达量最高，是野生型的16.8倍；表达量下调。、、、、在大部分植株中表达量均上调，其中OE植株中，和表达量高，而在OE植株中，、表达量高，表达量最高的是OE-L2植株中的。上述结果表明过表达后，及其相关基因中正向调控芪类物质合成的转录因子均不同程度上调表达，而与芪合酶存在底物竞争关系的下调表达（图5）。

A：VqSTS9、VqSTS21目的基因克隆VqSTS9 and VqSTS21 gene cloning；B：VqSTS9、VqSTS21的染色体定位Chromosome localization of VqSTS9, VqSTS21；C：VqSTS9、VqSTS21与欧洲葡萄氨基酸序列比对Amino acid sequence alignment of VqSTS9, VqSTS21 and STS from V. vinifera；D：VqSTS9、VqSTS21与不同物种STS氨基酸序列聚类分析，包括欧洲葡萄、松叶兰、樟子松、云杉、高粱、花生、桑、何首乌、大黄Cluster analysis of amino acid sequence of VqSTS9, VqSTS21 and STS from V. vinifera, Psilotum nudum, Pinus sylvestris, Picea abies, Sorghum bicolor, Arachis hypogaea, Morus alba, Fallopia multiflora, Rheum palmatum。登录号The accession number：VqSTS9（AFM56666.1）、VqSTS21（AFM56657.1）、VvSTS6（NP_001267934.1）、VvSTS2（XP_003634068.1）、PnSTS（BAA87924）、PsylSTS（CAA43165）、PaSTS（AEN84236.1)、SbSTS（AAL49965）、AhSTS（BAA78617）、MaSTS（ARM20004.1）、FmSTS（AFP97667.1）、RpSTS（AFX68803.1）

A：两个表达载体示意图schematic diagram of two expression vectors。B：VqSTS9、VqSTS21基因连接表达载体pCAMBIA2300的双酶切检测VqSTS9, VqSTS21 genetic connection expression vector pCAMBIA2300 double enzyme detection，M：DNA Marker；1：BamH Ι单酶切表达载体质粒The BamH Ι single enzyme expression vector plasmid；2：Sal Ι单酶切表达载体质粒the Sal Ι single enzyme expression vector plasmid；P：pCAMBIA2300的空载体质粒对照Empty vector pCAMBIA2300 as control；CK：空白对照Blank control (ddH2O)；3—5：BamH Ι和Sal Ι双酶切植物表达载体pCAMBIA35S::VqSTS9::GFP，3个重复double enzyme of BamH Ι and Sal Ι plant expression vector pCAMBIA35S: :VqSTS9: :GFP, three repeats；6—8：BamH Ι和Sal Ι双酶切植物表达载体pCAMBIA35S::VqSTS21::GFP，3个重复Double enzyme of BamH Ι and Sal Ι plant expression vector pCAMBIA35S::VqSTS21::GFP, three repeats。C：过表达载体转化农杆菌的菌液PCR检测PCR detection of Agrobacterium-transformed by overexpression vector，M：DNA Marker；P：阳性质粒对照positive plasmid control；1—3：农杆菌转化pCAMBIA35S::VqSTS9::GFP载体，3个重复agrobacterium-transformed pCAMBIA35S::VqSTS9::GFP vector, three repeats；4—6：农杆菌转化pCAMBIA35S::VqSTS21::GFP载体， 3个重复Agrobacterium-transformedpCAMBIA35S::VqSTS21::GFP vector, three repeats

2.6 转基因无核白植株抗白粉病分析

2.6.1 人工接种白粉病菌后转基因植株的抗病性表现为了研究转基因植株对白粉病的抗性，对转和无核白与野生型植株接种白粉病菌（图6-A），显微镜观察并统计接菌后 1—3 d每100个孢子的萌发数、初级菌丝与次级菌丝的数量，以及接菌7 d后分生孢子梗的数量（表2），染色结果（图6-B）显示在接种白粉病菌1 d后，植株叶片观察到接种的分生孢子，与野生型相比，转基因植株叶片孢子数量较少；接菌2 d和3 d后，转基因植株叶片初级、次级菌丝数少于野生型植株；在接菌7 d后，与野生型植株相比，转基因植株分生孢子梗的数量少。上述结果表明过表达和无核白植株对白粉病的抗性增强。

2.6.2 白粉病菌诱导下转基因植株的表达与产物分析对转基因植株与野生型植株接种白粉病菌，通过qRT-PCR分析接菌前后表达量的变化（图7-A、7-B）。结果表明在白粉病菌诱导后，响应其诱导表达上调，转基因植株中表达量显著升高，且与同时期的野生型植株相比始终保持较高水平。在OE-L1和OE-L2株系中，相对表达量分别在接菌后3 d和4 d达到峰值，是同时期野生型表达量的15.8倍与13.8倍；在OE-L2和OE-L3株系中，相对表达量分别在接菌后5 d和3 d达到峰值，是同时期野生型表达量的18.6倍与45.8倍。

接菌0 d和7 d，分析转基因植株与野生型植株中芪类物质含量与种类的变化（图7-C、7-D）。结果表明接菌前过表达无核白植株中检测到反式云杉新苷和反式白藜芦醇，而野生型植株只检测到反式云杉新苷；接菌7 d后，野生型植株的芪类物质种类在反式云杉新苷基础上增加了白藜芦醇（13.14 μg·g-1DW），一些过表达植株中检测到葡萄素。与接菌前相比，接菌 7 d 后芪类物质总含量显著提高，其中OE-L1植株比OE-L2芪类物质的含量和种类多，OE-L1的糖苷和白藜芦醇含量分别为接菌前的2.7倍和2.4倍，葡萄素含量为8.2 μg·g-1DW；植株OE-L2比OE-L3芪类物质含量多，OE-L2的糖苷和白藜芦醇含量分别为接菌前的1.6倍和2.1倍，葡萄素含量为18.3 μg·g-1DW。

A：无核白遗传转化过程The genetic transformation of Thompson Seedless，a：无核白分生愈伤组织meristem callus；b：侵染后的愈伤组织与农杆菌共培养the infected callus was co-cultured with a. tumefaciens；c：转化后的愈伤组织筛选培养callus screening culture after transformation；d：筛选60 d后的愈伤组织callus screening culture after 60 days；e：愈伤组织诱导出抗性芽callus induced resistant buds；f：抗性芽生根培养rooting culture of resistant bud；g：抗性芽长成植株resistant buds grow into plants；h：抗性植株的继代扩繁secondary propagation of resistant plants；i：继代后长成植株plant growth after succession；j：转基因植株移栽transplanting of transgenic plants。B：转基因植株的鉴定Identification of transgenic plants，a：转基因植株transgenic plants；b：PCR检测抗性植株PCR was used to detect resistant plants，M为marker，P为质粒M was marker, and P was plasmid；c：Western blot检测抗性植株Western blot was used to detect resistant plants

A：4个转VqSTS9株系的qRT-PCR 分析qRT-PCR analysis of 4 VqSTS9 transgenic lines；B：3个转VqSTS21株系的qRT-PCR分析qRT-PCR analysis of three VqSTS21 transgenic lines；OEVqSTS-Ls为转基因株系OEVqSTS-Ls were different transgenic lines

表2 每100个孢子萌发数、初级菌丝数、次级菌丝数和分生孢子梗数统计

数据表示为平均值±SE（=3）。同列数据后标有不同小写字母表示差异显著（＜0.05）

The data are shown as average±SE (=3). The lowercases after the data in the same column indicate significantly different (＜0.05)

3 讨论

要解决欧洲葡萄不抗病的问题，需要培育抗病品种，而抗病育种中抗病种质资源尤为关键。早期，研究者试图从欧洲葡萄品种中寻找抗病物质。1976、1979年，LANGCAKE等相继鉴定出葡萄中的白藜芦醇及衍生物[26-27]；1984年，Schöppner等首次分离与纯化了合成白藜芦醇的关键酶芪合酶[28]。关于葡萄转芪合酶基因，最早研究是在1990年，转花生的烟草原生质体在紫外灯诱导下检测到白藜芦醇[29]；研究表明，白藜芦醇不仅作为植保素具有抗病性，还具有生物学保健功能如抗癌、抗氧化、抗衰老等[8-10]。而芪合酶是白藜芦醇合成途径中的关键酶，可以响应并提高植物的抗病性[30]。因此，转芪合酶基因到其他植物成了研究的热点与重要领域，作为转基因受体的如番茄[31]、豌豆[32]、油菜[33]、大麦[34]、小麦[35]、葡萄[12]、番木瓜[36]等。笔者所在课题组前期也获得过表达的无核白植株[12,20-21]。研究证明转入外源，过表达植株对逆境胁迫的耐性增强并且使芪类物质积累。葡萄已被作为转基因及其产物白藜芦醇研究的模式植物，被广泛地用作抗性候选基因研究。将葡萄中作为改良植物抗性能力的目的基因，利用转基因技术在葡萄植物种内以及其他物种间进行遗传转化，从而提高植株抗病性。

A：用于接种白粉病菌的野生型无核白和转基因植株、与接种白粉病菌7 d的野生型和转基因的葡萄叶片wildtype Thompson Seedless and transgenic plants used for U. necator induction and leaves with induction 7 dpi；B：显微观察葡萄叶片上白粉病菌的生长。标尺=100 μm The growth progress of U. necator on grape leaves was observed microscopically. Scale bar=100 μm

有研究表明，在植物体内，芪类物质有白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素和紫檀芪[37]，这些衍生物具有与白藜芦醇相似的作用[38]，如葡萄素等能抑制霜霉菌菌丝生长[39]。本研究中，随着接种时间的增长，转植株芪类物质的量和种类均有所增加，特别是葡萄素的积累，说明转入的基因与获得的转基因植株具有抗病性。这与笔者课题组前期研究结果一致[12,40]。

在植物体内，通过苯丙氨酸代谢途径合成白藜芦醇[41]。合成包括一系列的酶反应，其中芪类化合物合成的关键酶是STS，它能够催化香豆酰-CoA和丙二酰-CoA合成白藜芦醇[42]。本研究通过qRT-PCR技术对转基因植株中与白藜芦醇合成相关的转录因子基因（、）、苯丙氨酸解氨酶基因（）、白藜芦醇糖基转移酶基因（）和查尔酮合成酶基因（）进行了表达分析。结果表明在转基因株系中，在携带CaMV35S启动子植物表达载体增强基因表达情况下，与野生型相比，不同程度地表达上调，这与CHENG等[12]研究结果一致。CaMV35S属于组成型启动子，其整合到双子叶植物基因组后，能够启动在不同器官、发育时期外源基因高强度的表达，但其活性在单子叶植物中受到限制[43]。PAL作为苯丙氨酸代谢途径中的第一个关键酶，能够催化合成香豆酸辅酶A，在转的植株中表达上调，可能是由于表达上调增加了对香豆酸辅酶A的消耗。转基因植株中表达上调，其可催化白藜芦醇糖基化，转化为云杉新苷，由于表达上调使得白藜芦醇合成增加，导致表达上调。与有共同的前体底物香豆酰辅酶A，转基因植株中表达下调，可能是因为两者存在底物竞争关系[44]。HÖLL等[45]研究发现，和能够正调控芪类物质的合成。本研究中，和不同程度地上调。因此，过表达和不仅提高了转基因植株的表达，还引起白藜芦醇合成途径中其他酶基因（、）和相关转录因子基因（、）的上调表达，从而促进芪类物质的积累。

A、B：接菌后STS相对表达量Relative expression of STS after inoculation；C、D：接菌0 d和7 d后芪类物质含量和种类检测The contents and types of stilbenes after inoculation 0 d and 7 d

转基因技术是一种的重要分子育种手段，在葡萄中已有转化成功的例子。一般葡萄用于遗传转化的受体材料主要包括通过体细胞胚发生途径诱导的胚性愈伤组织和器官发生途径诱导的分生愈伤组织。胚性愈伤组织起源于单细胞，可避免嵌合体的形成，但其诱导时间较长，诱导率低，受季节影响，使得转基因效率较低；而器官再生是由多个细胞共同发育分化形成的，在遗传转化时会有嵌合体形成但其诱导时间短，再生成苗率高，受季节影响较小[46]。本研究基于课题组前期遗传转化体系进行。通过构建携带目的基因的植物过表达载体，转入欧洲葡萄无核白中，获得抗性植株。转基因定向改良性状是今后精准育种的重要途径之一，但葡萄遗传转化效率受多方面因素的影响，包括基因型、受体材料（类型、状态）、侵染菌液浓度、共培养时间、抗生素筛选浓度等。因此，优化遗传转化体系与提高遗传转化效率是今后葡萄转基因定向改良目标性状的瓶颈技术问题。

4 结论

中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因、具有抗白粉病的功能，将、利用农杆菌转入欧洲葡萄无核白中，芪合酶基因表达产物种类与含量积累增加，表现出转基因植株对白病菌的抗性。因此，中国野生葡萄毛葡萄‘丹凤-2’是进行抗病育种的重要种质资源，、是重要的抗病基因资源，可进一步用作杂交亲本与欧洲葡萄品种杂交改进欧洲葡萄品种抗病性。

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Expression of Stilbene Synthase Genes from Chinese Wildand Its Effect on Resistance of Grape to Powdery Mildew

DING Xi, ZHAO KaiXi, WANG YueJin

College of Horticulture, Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas/Key Laboratory of Horticultural Plant Germplasm Resource Utilization in Northwest China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yangling 712100, Shaanxi

【】Two stilbene synthase () genes from Chinese wild‘Danfeng-2’ (and) were cloned and functionally investigated with the aim to provide a theoretical basis for improving the disease-resistance and quality of.【】Homologous cloning was applied to obtainandand their overexpression vectors under the control of CaMV35 promoter were constructed, respectively. The calluses were induced from single bud segment ofcv. ‘Thompson seedless’, which were used as the receptor materials. The resistant ‘Thompson seedless’ plants were obtained via-mediated genetic transformation. Furthermore, the disease-resistant transgenic plants were determined by different levels of detection. The leaves of wild-type (WT) and transgenic plants were inoculated with, the pathogenic conditions of leaves infected withwere observed by microscope to compare their resistance. The expressions ofand other genes in the metabolic pathway of resveratrol synthesis were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in WT and transgenic plants under natural conditions and after inoculation with. The types and contents of stilbenoids in transgenic plants were determined by HPLC.【】The cDNA sequences of(JQ868689) and(JQ868677) from the Chinese wildaccession‘Danfeng-2’ were cloned, and both were 1 179 bp in length. Four-overexpressing and threeoverexpressing plants were confirmed by PCR and Western blot analysis. These transgenic plants enhanced resistance to powdery mildew and reduced hyphae growth compared with WT plants through observing the growth of. The qRT-PCR results indicated thatandtransgenic plants increased the expressions of, its upstream, the downstream, and transcription factor genes,under the natural conditions when compared with WT plants. However, the expression ofwas down-regulated. After inoculation, the expression ofin transgenic plants was significantly up-regulated compared to WT. HPLC determination demonstrated that the stilbenoids mainly existed as the form of-piceid, and its content in transgenic plants was higher than that in WT under natural conditions. After inoculation, the expression ofwas induced, and-piceid,-resveratrol and viniferin were also produced. Compared with WT plants, the types and contents of stilbenoids in transgenic plants increased.【】Overexpression ofand, increase the types and contents of stilbenoids, and further inhibit the growth of. Therefore, ‘Danfeng-2’ is an important germplasm resource for disease-resistant breeding and quality improvement of. Stilbene synthase genesandcan improve resistance to powdery mildew of

Chinese wild; stilbene synthase gene (); resveratrol; powdery mildew; genetic transformation; disease-resistance