杨浩天，邱 博，宋浩静，董占军

（河北省人民医院药学部，河北石家庄 050051）

双丹方由丹参、牡丹皮配伍而成，方中丹参味苦，性微寒，归心、肝经，有通经止痛之功效；牡丹皮性味归经与丹参相近，可使血凉而不淤，血活而不妄行，两药合用时可增强活血化瘀功效，临床上常用于治疗心脉淤阻所致的冠心病、心绞痛等症［1］。它因其疗效确切而被开发成多种剂型，包括胶囊、颗粒、口服液［2-3］，三者功能主治虽相同，但制剂中两药配比、生产工艺等均有所差异。中药药效不仅取决于特征成分含量，更受其他活性成分影响，故双丹方相关制剂的药效物质基础及作用机理仍值得探讨。

丹参活性成分大多为二萜类、酚类衍生物，而牡丹皮中丹皮酚含量较高［4-9］，对两者药效评价的研究较多，但配伍过程中其所含成分的结构及含量均发生变化，而且目前相关检测方法大多为HPLC法［9］，并不适用于无紫外吸收或痕量物质的分析。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）法灵敏度高，专属性强，简便高效，被广泛地应用于中药复方活性成分的测定［10-11］，故本实验采用该方法同时测定双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸的含量，以期为相关制剂的质量控制及临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-30A 型超高效液相色谱系统（日本Shimadzu 公司）；Triple Quad 5500 型三重四极杆MS 仪，配置Analyst 1.6 数据采集系统（美国AB Sciex 公司）；BP211D 型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；S150 实验室应用型超声波清洗器（德国Elma 公司）；Sorvall ST16R 型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；MIULAB MIX-25P 型涡旋仪（杭州米欧仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 丹参酮ⅡA（纯度99.5%，批号110766-201721）、丹皮酚（纯度99.9%，批号110708-201407）、没食子酸（纯度90.8%，批号110831-201605）、原儿茶酸（纯度99.9%，批号110809-201205）对照品均购自中国食品药品检定研究院；丹参素（纯度98.0%，批号180628）对照品购自北京普天同创生物科技有限公司；丹酚酸B（纯度98.0%，批号18071704）、迷迭香酸（纯度98.0%，批号17081316）对照品均购自上海士锋生物科技有限公司。双丹胶囊（广州莱泰制药有限公司，批号181007、181104、190414）；双丹颗粒（山东孔圣堂制药有限公司，批号1901004、1901007、1901105）；双丹口服液（北京九龙制药有限公司，批号190101、190116、190312）。乙腈、甲酸均色谱纯（德国默克公司）；水为超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 XBridge BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0～2.0 min，5%～30% A；2.0～3.5 min，30%～75% A；3.5～5.5 min，75%～90% A；5.5～6.0 min，90%～5%A；6.0～6.5 min，5%A）；体积流量0.5 mL／min；柱温35 ℃；进样量5 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾电离源（ESI），多反应监测模式（MRM），正负离子同时扫描；温度550 ℃；喷射电压5 500 V（ESI+）、-4 500 V（ESI-）；雾化气（Gas 1）、加热气（Gas 2）压力55 psi（1 psi＝0.133 kPa）；气帘气压力35 psi。各成分参数见表1。

表1 各成分MS 参数Tab.1 MS parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备 精密称取丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸对照品适量，置于10 mL 量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取适量，50%乙腈稀释，即得（各成分质量浓度分别为1 140.0、2 675.0、2 725.0、1 680.0、488.0、156.0、137.5 ng／mL）。

2.4 供试品溶液制备 取双丹胶囊内容物、双丹颗粒适量，置于研钵中充分研磨均匀，分别取约500 mg，精密称定，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 50%乙腈，称定质量，超声提取60 min，放冷，50%乙腈补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，50% 乙腈稀释100 倍，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，即得；精密量取双丹口服液1 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，稀释1 000 倍，即得。

2.5 专属性试验 在本实验所用色谱和质谱条件下，各成分峰形良好，且无杂峰干扰，表明方法专属性强。各成分对照品、供试品色谱图见图1。

图1 各成分LC-MS／MS 色谱图Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密量取“2.3”项下对照品溶液适量，50% 乙腈稀释成系列质量浓度，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，并分别以S／N ＝10、S／N ＝3 时为定量限、检测限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 取“2.3”项下中间质量浓度的对照品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定6 次，测得丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸峰面积RSD 分别为2.1%、1.8%、0.7%、2.4%、1.2%、1.5%、2.6%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取供试品溶液（双丹胶囊批号181007，双丹颗粒批号1901004，双丹口服液批号190101），于室温下放置1、2、4、8、16 h 后，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，测得双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸峰面积RSD 分别为1.4%、2.2%、1.7%、3.5%、2.4%、3.7%、2.8%；2.6%、1.9%、3.1%、3.3%、2.8%、1.1%、3.6%；2.3%、4.2%、1.9%、3.0%、1.4%、2.7%、2.5%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批双丹胶囊（批号181007）、双丹颗粒（批号1901004）、双丹口服液（190101），按“2.4”项下方法各平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，测得双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸含量RSD 分别为1.4%、2.2%、1.7%、3.5%、2.4%、3.7%、2.8%；2.6%、1.9%、3.1%、3.3%、2.8%、1.1%、3.6%；2.3%、4.2%、1.9%、3.0%、1.4%、2.7%、2.5%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的双丹胶囊（批号181007）、双丹颗粒（批号1901004）各250 mg，精密量取双丹口服液500 μL，各加入对照品溶液500 μL，平行6 份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，双丹胶囊中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸平均加样回收率分别为97.9%、101.4%、98.3%、97.1%、102.6%、100.5%、98.2%，RSD 分别为3.6%、2.6%、3.0%、1.8%、2.5%、1.4%、3.1%；双丹颗粒中各成分平均加样回收率分别为102.3%、98.1%、101.8%、97.6%、98.3%、102.1%、96.7%，RSD 分别为 2.1%、2.4%、1.1%、3.3%、1.9%、2.5%、3.8%；双丹口服液中各成分平均加样回收率分别为99.2%、97.0%、102.5%、100.7%、98.1%、101.9%、99.4%，RSD 分别为3.6%、2.4%、3.7%、1.5%、4.5%、1.8%、2.0%。

2.11 样品含量测定 取不同批号双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液各3 批，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

由此可知，3 种制剂、同一制剂不同批次中各成分含量均存在差异，由于制剂在生产过程中的工艺参数相对固定，故造成上述现象的原因主要为原材料（药材或饮片）质量良莠不齐。中药品种庞杂，产地广泛，同名异物、同物异名现象普遍存在，当前药材、饮片、成方标准的制定思路是控制其中1 种或几种有效或特征成分的含量，而“中药质量标志物（Q-Marker）”这一概念的提出则完善健全了相关质量标准体系［12］。

表3 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n＝3）

2.12 日均摄入量测定 由于患者服药后各成分摄入量更能真实地反映中成药量效关系，故本实验结合药品说明书及临床用法用量折算各成分日均摄入量，结果见表4。由此可知，3 种制剂中各成分日均摄入量差异较大，由高及低依次为双丹口服液、双丹颗粒、双丹胶囊；主要有效成分丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚总摄入量占比均高于80%，其中丹参酮ⅡA、丹酚酸B 在双丹颗粒中最高，丹参素、丹皮酚在双丹口服液中最高，上述现象可归因为各类制剂生产工艺不同。2015 年版《中国药典》 中双丹口服液的制备工艺采用水提醇沉法，可较大程度地将有效成分溶出，并且能去除部分杂质，但对双丹颗粒、双丹胶囊剂的制备方法鲜有报道［13-14］。中药配伍发挥疗效具有多成分、多靶点协同作用的特点，是一个复杂的体内过程，故药物作用强度除了与制剂中主要有效成分含量密切相关外，其作用方式、生物利用度、不同剂型对其体内吸收的影响等因素也会影响疗效［15］。

表4 各成分日均摄入量测定结果（mg／d， n＝3）Tab.4 Results of daily average intake determination of various constituents（mg／d， n＝3）

3 讨论

3.1 固体制剂提取条件筛选 本实验考察了25%、50%、75% 甲醇及25%、50%、75% 乙腈，发现乙腈提取率略高于甲醇；以50% 或75% 乙腈超声60 min 时，双丹胶囊、双丹颗粒中各成分提取率均高于25%乙腈超声提取时，并且50%、75%乙腈超声提取时差异较小。再考察了超声时间30、60、90 min，发现提取60 min 或90 min 时各成分提取率均高于提取30 min 时，而提取60、90 min时无显著差异。因此，为控制试剂成本，提高实验效率，确定双丹胶囊、双丹颗粒最优提取条件为50%乙腈超声60 min。

3.2 色谱条件筛选 本实验考察了不同型号、粒径的色谱柱，发现 XBridge BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）可实现各成分较好的分离。再考察了乙腈-水、乙腈-水（含0.1% 甲酸）、甲醇-水、甲醇-水（含0.1%甲酸），发现以乙腈-水（含0.1% 甲酸）梯度洗脱时可获得良好的峰形及较快的分析速度，故以其流动相。

3.3 质谱条件筛选 由于各成分在结构、极性等方面存在差异，故本实验采用正负离子模式对其响应值进行考察。结果显示，丹参酮ⅡA 在正离子扫描模式下响应更强，而丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸在负离子扫描模式下具有更高的响应值。为了兼顾各成分测定以使其具有较高的灵敏度，本实验采用MRM 正负离子同时监测模式进行质谱分析。

4 结论

本实验建立UPLC-MS／MS 法同时测定双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸的含量，该方法灵敏、快速、准确，可用于相关制剂的质量控制与评价，并为其药效物质基础的进一步研究提供参考。