宋杨一嫣综述 李 文 审校

肺癌是起源于支气管黏膜上皮或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率在国人所患癌症中均居首位[1]，严重威胁生命和健康。其中，非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)在临床上最常见，占肺癌患者总数的80%-85%[2]。手术、放化疗和分子靶向药物等治疗措施可极大地改善NSCLC患者预后，但由于肺癌细胞对化疗和分子靶向药物的耐药性而严重降低了治疗获益。如何拮抗NSCLC耐药成为近年来临床关注和研究的重要课题。

近年研究表明，微小RNA(microRNA, miRNA)在调控肿瘤细胞增殖、分化、衰老和凋亡过程中扮演着关键角色，并参与调节多种肿瘤的耐药发生[3]。miR-34是一类保守的、非编码miRNA，共有3个家族成员，分别为miR-34a、miR-34b和miR-34c，作为抑癌基因，已发现在多种肿瘤细胞中低表达，对肿瘤的诊断、治疗、耐药和预后有重要作用[4]。本文主要对近年来miR-34在NSCLC耐药中的研究现状和进展进行综述。

1 miR-34结构和分布

miR-34于2001年在线虫中被首次发现，其家族成员包含miR-34a、miR-34b和miR-34c，广泛分布于哺乳动物、线性动物和节肢动物体内。miR-34家族成员在结构序列上具有高度同一性，但却由两套转录本组成。其中，miR-34a具有唯一的转录物，由110个核甘酸序列组成，定位于1号染色体短臂(1p36.22)，其茎环结构序列分别位于1号染色体第9、134、314位至第9、134、423位负链上。miR-34b

和miR-34c共用1套转录物，均定位于11号染色体长臂(11q23.1)。略有不同的是，miR-34b由84个核苷酸序列组成，其茎环结构序列位于11号染色体第110、888、873位至第110、888、956位正链，而miR-34c由77个核苷酸序列组成，其茎环结构序列位于第110、889、374位至第110、889、450位正链上。在正常人体和小鼠组织内，miR-34家族成员的表达各不相同，miR-34b和miR-34c主要在肺组织中高表达，而在肺外组织中，miR-34a的表达高于miR-34b和miR-34c。但是在肿瘤组织中，受抑癌基因p53调控和CpG岛甲基化的影响，miR-34a、miR-34b和miR-34c表达均低于正常组织[5]。

2 miR-34在NSCLC中的作用

2.1 miR-34在NSCLC中的表达

研究[6]表明，miR-34随胎儿肺的发育而逐渐表达，可能对肺发育过程有重要作用，这也为肺脏疾病的研究提供了新思路。针对NSCLC患者而言，miR-34可以调控血小板源生长因子受体α和β (PDGFR -α和PDGFR -β)，促进肿瘤坏死因子配体超家族成员10 (TRAIL)诱导细胞凋亡和减少癌细胞的侵袭性，从而抑制癌细胞的迁徙和浸润[7]。一项纳入196例NSCLC患者的临床研究显示，miR-34a和miR-34c在血浆和肿瘤组织中的表达水平与NSCLC患者无病生存期和总体生存期延长呈正相关，而miR-34b的表达与此无相关性，因而认为miR-34a和miR-34c可以作为NSCLC患者预后的标志物[8]。Daugaard等[9]评估了miR-34异常表达与肺腺癌患者远处转移的关系，结果发现miR-34b和miR-34c的低表达与肺腺癌患者的远处转移呈正相关，提示miR-34b和miR-34c可能参与肺腺癌的转移过程。

2.2 miR-34在NSCLC中的作用

作为受p53直接调控的miRNA，miR-34已被多项研究证实具有抑制NSCLC发生、发展的作用[10, 11]。Shi等[10]将miR-34a转染H1299、H460和A549 3种人NSCLC细胞系，结果发现miR-34a转染可以抑制3种NSCLC细胞系的全克隆形成和克隆扩增能力。肿瘤移植实验也表明，miR-34a过表达可抑制肿瘤的发生和生长，而miR-34a拮抗剂可以促进肿瘤的生长和发展。天然活性物质没食子酸可通过激活p53和miR-34a，降低表皮生长因子(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)磷酸化水平和程序性死亡受体1(Programmed Cell Death Protein-1, PD-1)表达，抑制NSCLC瘤体生长和转移[11]。Feng等[12]研究证实，miR-34b通过与细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin-Dependent Kinase 4, CDK4)mRNA的3'-UTR区域结合，干扰CDK4表达，进而阻滞H1299和A549细胞的细胞周期、诱导细胞凋亡。miR-34c也被证实通过靶向真核生物翻译起始因子4E (Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E, eIF4E)，抑制A549细胞的增殖、转移和侵袭[13]。还有研究证实，miR-34可能调控正常干细胞和肿瘤干细胞的功能，抑制肿瘤转移和复发[14]。

3 miR-34在NSCLC耐药中的作用机制

3.1 抑制上皮-间充质转化

上皮-间质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是一种重要的自然生理现象，首次发现于胚胎发育过程。最初认为EMT主要参与胚胎形成和器官成形，后来发现其在组织损伤后修复、再生过程和肿瘤发生中具有重要作用。上皮细胞拥有游离面-基底面极性、细胞-细胞间黏附和运动能力低等特性，当发生EMT后，上皮细胞丢失已分化表型，发生细胞骨架重组，细胞结构由多边形转变为梭形的纤维细胞样形态，极性消失、细胞间黏附能力下降，从而获得间充质细胞的生物学特性，包括迁移、侵袭、降解细胞外基质和抗凋亡等。在人类肿瘤和实验动物模型中，EMT已被多项研究证实其参与了肿瘤的侵袭、转移和耐药过程[15]。MiR-34可能逆转EMT过程抑制肿瘤细胞耐药性。Zhou等[16]报道，在EGFR突变阳性的NSCLC中，肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)可以调控磷酯酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3 Kinase, PI3K)信号通路，诱导获得性吉非替尼耐药。而在HGF诱导的吉非替尼耐药小鼠肿瘤移植模型中，过表达miR-34a可通过逆转EMT过程，抑制吉非替尼耐药性HCC827和PC-9细胞株的生长，诱导细胞凋亡，从而抑制吉非替尼耐药[16]。小檗碱可上调miR-34a，增强吉非替尼对NSCLC小鼠的抗肿瘤效应[17]。还有研究表明，miR-34c过表达通过靶向性别决定区Y框蛋白4(Sex Determining Region Y Box Protein 4, SOX4)信号，抑制EMT过程，恢复肿瘤细胞对顺铂的敏感性，而降低miR-34c水平则促进EMT过程，诱导顺铂耐药[18]。

3.2 改善抗凋亡机制失衡

细胞凋亡是细胞受到各种病理刺激后出现的一种程序性死亡过程。细胞凋亡受多种凋亡相关基因及蛋白酶的调控，包括抑制凋亡基因如Bcl-2、Bcl-xl、survivin和X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein, XIAP)等，促进凋亡基因如p53、Fas、Bax和Bad等。研究表明，化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程依赖于正常的细胞凋亡途径，如果肿瘤细胞的抗凋亡机制增强或凋亡通路缺陷，则容易出现耐药[19]。因此，改善抗凋亡机制失衡，促进肿瘤细胞凋亡可成为逆转NSCLC耐药的有效途径。作为受p53直接调控的miRNA，miR-34已被多项研究证实可以靶向调控Bcl-2、survivin和XIAP等多种细胞凋亡抑制因子，如过表达miR-34a通过靶向Bcl-2信号，抑制肺腺癌的形成和进展[20]，中药复方配方JP-1通过激活P53/miR-34a轴，下调survivin和c-Myc(Cell-cycle Progression)水平，上调Bax和caspase-3表达，促进肺腺癌细胞凋亡[21]。miR-34c过表达可上调Bax和高迁移率族蛋白-1表达，抑制A549和人非小细胞肺腺癌细胞系(NCI-H157)细胞的增殖，诱导细胞凋亡[22]。表明miR-34通过改善抗凋亡机制失衡，减少耐药，增强化疗效果。

3.3 调控肿瘤干细胞

肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell, CSC)是一类可以无限增殖、具有自我更新和分化潜能的肿瘤细胞群体，由正常组织干细胞受多种病理因素长期诱导、多步叠加而出现细胞增殖和分化失衡转化而来。其在染色质水平的端粒酶活性增强，并通过延长端粒，赋予CSC无限增殖潜能，以及CSC内，膜转运蛋白活性、抗凋亡信号通路、增殖和迁移相关信号通路的活性均大大增强。目前，CSC已被证实参与一系列肿瘤活动，包括促进肿瘤复发和转移、加快肿瘤滋养血管生成和增强放化疗耐受性等[23]。因此，CSC可能是防止NSCLC转移及复发、减少肿瘤耐药性的重要靶点。研究表明，Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎肺发育和肺部肿瘤发生中起重要作用，可以调控肿瘤细胞和CSC的增殖、分化过程。Hh信号通路抑制剂环杷明可以上调miR-34a表达，降低CSC标志物CD133和CSC水平；降低CSC活性，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[24]。 此外，亦有研究指出，miR-34a过表达还可下调Notch1通路表达，负向调控CSC标志物乙醛脱氢酶1 (Aldehyde Dehydrogenase 1, ALDH1)和CSC的增殖，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[25]，提示miR-34可调控CSC水平，提高化疗药物敏感性。

3.4 协同抗耐药

目前，将化疗或分子靶向药物与基因药物整合到一起，靶向运输至特定的肿瘤组织中，利用二者的协同作用，提高化疗和分子靶向药物敏感性已逐渐成为肿瘤研究领域的热点。研究表明，miRNAs let-7和miR-34a在TP53基因和KRAS基因突变的NSCLC细胞中的表达均显著降低[26]。miRNAs let-7和miR-34a联合应用可增强酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors, TKI)厄洛替尼对NSCLC细胞的抑癌效应，却不影响顺铂、依托泊苷或紫杉醇介导的抗NSCLC细胞增殖作用，提示miR-34a可增强厄洛替尼的抗肿瘤效应[26]。Zhao等[27]的研究也证实，miR-34a与厄洛替尼有很强的协同作用，可显著提高后者对厄洛替尼耐药性NSCLC细胞的抗增殖和促细胞凋亡作用。Xue等[28]利用肺靶向纳米颗粒将miR-34a传递至肺腺癌耐药小鼠，发现miR-34a可以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，而且与单用顺铂化疗相比，miR-34a可提高顺铂的化疗效果，延长小鼠的生存期。此外，Yang等[29]利用核酸适配体，将miR-34c模拟物靶向传递给NSCLC细胞，结果显示miR-34c可直接抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭，减缓肿瘤生长；miR-34c与紫杉醇或顺铂联合应用也可显著抑制肿瘤生长。表明miR-34联合化疗或分子靶向药物可能是克服NSCLC耐药的有效策略。

3.5 其它机制

除了上述作用外，亦有研究报道miR通过其它分子机制逆转NSCLC耐药过程。Zuo等[30]研究表明，在顺铂耐药细胞中，程序性细胞死亡配体-1(Programmed Cell Death Protein Ligand 1, PD-L1)表达升高而miR-34a表达降低；进一步研究表明，miR-34a通过靶向 PD-L1的3'-UTR区负性调控PD-L1的表达，且PD-L1沉默可降低miR-34a模拟物对顺铂耐药的敏感性。提示miR-34a/PD-L1轴在顺铂耐药过程中具有重要作用。Xiong等[31]也证实，在吉非替尼获得性耐药的NSCLC小鼠模型中，AxI表达升高而miR-34a表达降低；miR-34a通过负性调控AxI表达，可逆转吉非替尼耐药。Palma等[32]研究表明，miR-34c通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)，抑制KRAS突变细胞的增殖，促进细胞凋亡，提示miR-34c可能是拮抗NSCLC耐药的重要靶点。

4 小 结

作为抑癌基因，miR-34在NSCLC中的作用已得到众多研究的证实。miR-34在NSCLC中低表达，通过调控NSCLC细胞的增殖、转移、侵袭和凋亡等生物学过程，发挥抑癌作用。此外，miR-34通过抑制EMT、改善抗凋亡机制失衡、调控肿瘤干细胞、协同抗耐药和特定信号通路等多种机制，拮抗NSCLC耐药。目前，尽管研究者已经了解到miR-34在NSCLC发生、发展和耐药过程中的重要性，但其具体作用机制尚未完全明确。因此，对miR-34的深入研究，有助于进一步加深对NSCLC的认识，阐明miR-34在NSCLC发生、发展、耐药的机制，为临床防治NSCLC提供新思路。

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