郭 浩，赵 科，郭小彬，杨宏昕

(内蒙古自治区人民医院药学处，内蒙古 呼和浩特 010017)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)为肺癌常见类型之一，发病率约为80%，主要临床特点为恶性肿瘤细胞增殖缓慢、转移扩散较晚[1]。手术是治疗NSCLC的首选方法，但大多数NSCLC患者发现时已错过手术机会，NSCLC虽然对放化疗敏感，但放化疗后NSCLC的缓解率仅约15%～35%[2]。近年来，靶向治疗成为肿瘤研究的热点，其中抗血管生成治疗广受关注，并被美国《科学》杂志评为“世界十大科技突破”[3]。作为新型表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，吉非替尼被广泛应用于治疗EGFR外显子19缺失或外显子21点(L858R)缺失的患者，包括肺癌、卵巢癌[4]、乳腺癌[5]和结肠癌等[6]；约80%携带EGFR突变阳性的NSCLC患者经吉非替尼治疗后无进展生存期显著延长[7]。随着化疗次数的增加，机体会对化疗药逐渐产生耐药性，降低临床疗效。因此，如何克服耐药性，提高肺癌患者化疗后的缓解率，是目前亟需解决的主要问题。查阅中国知网、万方数据库等发现，国内针对吉非替尼耐药的NSCLC患者临床治疗的相关研究较少，本研究针对这一现状探讨了舒尼替尼用于对吉非替尼耐药的NSCLC的作用，以期为临床治疗NSCLC提供更可靠的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

随机选取2017年1月至2019年1月于内蒙古自治区人民医院就诊的NSCLC患者75例；其中男性43例，女性32例；平均年龄(58.62±15.69)岁；鳞癌27例，腺癌48例；肿瘤≥3 cm的患者19例，肿瘤<3 cm的患者56例；TNM分期Ⅰ—Ⅱ期的患者15例，Ⅲ—Ⅳ期的患者60例。所有患者年龄、性别等临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)所有患者均经临床与病理检查证实为对吉非替尼耐药的NSCLC患者；(2)所有患者均同意将手术切除的恶性肿瘤组织用于本研究，并签署知情同意书；(3)所有患者的临床资料完整[8-9]。排除标准：(1)具有严重心脏、肝脏等重要脏器衰竭者；(2)具有严重认知功能障碍，不能配合检查者；(3)具有乙型肝炎等传染性疾病者。本研究已取得伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：经患者知情并同意后，对其肿瘤组织进行切除，提取恶性肿瘤细胞后进行原代培养。通过胶原酶与分散酶消化30 min后，以1 000 r/min离心8 min，去上清液，用0.25%胰蛋白酶消化10 min后，以1 000 r/min离心10 min，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的完全培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。提取细胞总RNA并测定其纯度以及浓度。

1.2.2 吉非替尼和舒尼替尼以及吉非替尼联合舒尼替尼对细胞增殖率的影响：取对数生长期细胞以每孔150 μl接种于96孔板，细胞贴壁后，分别加入吉非替尼(0、1.5、3、6、12和24 μmol/L)、舒尼替尼(0、1.5、3、6、12和24 μmol/L)以及舒尼替尼(1.5 μmol/L) 联合不同浓度的吉非替尼(0、1.5、3、6、12和24 μmol/L)进行药物干预，对照组仅含有二甲基亚砜(DMSO)的溶剂；继续培养72 h后加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)(5 g/L)10 μl，37 ℃培养4 h后低速离心10 min吸弃上清液，再加入DMSO 150 μl，充分振荡使沉淀充分溶解，用酶联免疫检测仪在波长570 nm处测定吸光度(OD)，实验重复3次。细胞生长抑制率(%)=(实验组平均OD-空白组平均OD)/(对照组平均OD-空白组平均OD)×100%，空白组为含有0 μmol/L舒尼替尼。采用直线回归方法计算药物的半数抑制浓度(IC50)，实验重复3次。

1.2.3 Western blot法检测：(1)细胞总蛋白提取及定量。将不同处理后的细胞用胰酶消化后，以6 000 r/min低温离心5 min收集细胞，预冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤，重悬，再离心，重复3次后弃上清，加入含有1%蛋白酶抑制剂细胞裂解液，吹匀后冰上放置15 min，以14 000 r/min低温离心15 min，上清为总蛋白提取液，通过考马斯亮蓝法测定其浓度。(2)SDS-PAGE凝胶电泳。取蛋白提取物约50 μg，加入蛋白上样缓冲液，超纯水补足不足体积，总反应体系30 μl，煮沸5 min后进行电泳。设置恒压80 V(8 V/cm)，当染料前沿进入分离胶30 min后，提高电压至100～120 V(15 V/cm)，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。(3)将电泳产物转移至常规PVDF膜，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭液封闭过夜。血管内皮生长因子(VEGF)(1∶1 000)、血小板衍生生长因子(PDGF)(1∶1 000)、多药耐药(MDR)(1∶800)以及核因子κB(NF-κB)(1∶800)抗体4 ℃孵育过夜，1∶2 000稀释的HRP标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，用TBST洗3次，ECL显色液显色。目的条带用Image-Pro Plus分析软件进行灰度值分析，以β-actin为内参照校正。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MTT法检测舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞的增殖抑制作用

1.5 μmol/L的舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞的增殖抑制率为(16.78±1.21)%，细胞毒性较低，因此，后续选择1.5 μmol/L的舒尼替尼进行实验，见图1。

图1 舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞增殖抑制作用

1.5 μmol/L的舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞的IC50为(30.57±1.86) μmol/L，显著低于0 μmol/L舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞的IC50[(45.62±1.79) μmol/L]，提示舒尼替尼可显著增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性，降低吉非替尼抑制耐药细胞增殖的IC50，见图2。

图2 舒尼替尼影响耐药细胞对吉非替尼的敏感性

2.2 Western blot法蛋白测定

Western blot法检测结果显示，1.5 μmol/L舒尼替尼处理后的MDR、NF-κB、VEGF以及PDGF蛋白表达水平均有所降低，见图3。通过对灰度值的分析发现，上述4种蛋白中PDGF表达量降低44.38%，影响最为显著，其次为MDR(降低32.51%)；NF-κB蛋白表达量受舒尼替尼的影响最小，见表1。

图3 舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞中MDR、NF-κB、VEGF及PDGF蛋白表达影响

表1 1.5 μmol/L舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞中MDR、NF-κB、VEGF及PDGF蛋白表达的灰度值

3 讨论

吉非替尼耐药包括原发性耐药和继发性耐药，其耐药机制主要与EGFR的二次突变、c-Met扩增、代偿信号建立与调节因子表达改变和肿瘤微环境改变等相关[10]；其中，发生原发性耐药的原因包括K-ras突变和PTEN功能丧失[11]。有研究结果表明，NSCLC发生K-ras突变常提示对于吉非替尼天然耐药，此外还可提示肿瘤预后不佳[12]。对于K-ras突变诱发的肿瘤对吉非替尼天然耐药的原因，可能与该突变导致的Erk或Akt活化有关[13]。舒尼替尼为一种新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制多种酪氨酸激酶，理论上讲，同时阻断VEGF、PDGF及其他多种酪氨酸激酶活性比单独阻断1种酪氨酸蛋白激酶活性的抗肿瘤效果更强[14]。舒尼替尼在肾细胞癌和胃肠间质瘤的治疗中已显示出确切的抗肿瘤效应。魏长江等[15]对比了舒尼替尼与帕尼单抗治疗晚期NSCLC的临床疗效，发现舒尼替尼组患者的治疗有效率、病情控制率、生活质量、无进展生存期和总体生存期均优于帕尼单抗组，但舒尼替尼易引发较为严重的不良反应。2007年，美国临床肿瘤学会年会上发布了一项关于舒尼替尼联合吉非替尼治疗31例转移性肾细胞癌患者的Ⅱ期临床研究的初步结果，提示舒尼替尼联合吉非替尼治疗转移性肾细胞癌具有较好的耐受性和临床有效性[16]。

探讨舒尼替尼用于对吉非替尼耐药的NSCLC的临床疗效研究较少。郁莉等[17]经研究发现，舒尼替尼可显著增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性，降低吉非替尼的IC50。本研究在上述研究的基础上进一步发现，舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞株中PDGF蛋白表达水平的影响最为显著，其次为MDR、VEGF。众所周知，新血管的形成在肿瘤生长中发挥了关键作用，一些促血管形成因子可以促进肿瘤血管的形成。在生理或病理血管形成过程中，VEGF具有重要的作用[18]。PDGF在其受体介导下发挥着强有丝分裂原的作用，还可以调节细胞外基质的合成及分解，是较为重要的血管形成因子。研究结果证实，NSCLC组织分泌了大量的PDGF-B、PDGFR-α，两者的阳性表达高达85%及以上，与正常的癌旁组织相比差异有统计学意义，说明PDGF信息传导通路组成部分有可能参与了NSCLC的发生、发展[19]。本研究结果表明，舒尼替尼可能主要通过下调吉非替尼耐药细胞株中PDGF蛋白表达，从而增强细胞对吉非替尼的敏感性，但PDGF信号通路与肺癌细胞对吉非替尼耐药机制的关联性需要进一步研究。

本研究结果进一步证实了舒尼替尼与吉非替尼具有协同作用，舒尼替尼可显著增加吉非替尼耐药细胞的敏感性。其机制可能与舒尼替尼可以降低吉非替尼耐药细胞中PDGF、MDR以及VEGF蛋白表达相关，但需要进一步研究进行验证。本研究主要针对舒尼替尼对吉非替尼原发性耐药细胞进行研究，但在临床中大多数NSCLC患者属于继发性耐药，因此，对于舒尼替尼逆转NSCLC继发性吉非替尼耐药的研究更具有临床价值。