程 贤，毕良武*，李胜男，陈玉湘，赵振东，莫开林

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042；2.四川省林业科学研究院，四川 成都 610081)

油樟是中国特有的樟科樟属树种，主要分布在我国的四川省，此外，湖南、广东、重庆等省市也有种植[1]。油樟精油的主要成分包括醇类、烃类、酯类、醛类等[2]。醇类成分以1,8-桉叶油素和α-松油醇为主，烃类以萜类为主，包括γ-松油烯、α-蒎烯和石竹烯等[3]。油樟精油的主要成分具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用，是天然抗氧化剂的重要来源，具有广阔的应用前景[4-6]。李嘉欣等[7]采用DPPH、ABTS、FRAP法对樟树精油的体外抗氧化活性进行评价，研究表明：油樟精油质量浓度为8 g/L时，对DPPH自由基的清除率约20%，对ABTS自由基也有一定的清除能力。王艺蓓等[8]用近红外技术对加入油樟精油样品的 DPPH和ABTS溶液进行光谱分析，结果表明：油樟精油对两种自由基具有较高的清除率。史峻铭等[9]研究表明采用低共熔溶剂微波辅助蒸馏法获得的油樟精油对ABTS自由基的清除能力远高于DPPH自由基。由此可见，油樟精油在治疗氧化应激相关疾病，如癌症、糖尿病和心血管疾病方面具有一定的药用价值，在开发食品天然防腐剂及抗氧化剂等方面具有广阔的应用前景。因此，油樟精油的化学成分和生物活性研究仍然是油樟研究的重点。目前，对不同季节油樟叶的精油化学成分及抗氧化活性变化的研究未见报道，同时对于不同季节油樟油细胞形态变化也鲜有报道。本研究以不同季节采集的油樟叶为研究对象，首先利用光学显微镜对油细胞密度、直径进行对比研究，利用扫描电镜(SEM)在超微水平上进一步观察油细胞；其次利用GC-MS对水蒸气蒸馏法提取所得精油进行成分分析，利用GC对精油主成分进行含量测定；最后对精油的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力进行评价，初步探索不同季节对油樟叶精油品质的影响，以期为油樟叶的科学采集提供参考。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

1,8-桉叶素(纯度98%)、α-松油醇(纯度95%)和γ-松油烯(纯度95%)均购自上海麦克林生化科技有限公司；戊二醛水溶液(体积分数2.5%)，国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸(Vc)、氢氧化钠、双氧水、无水乙醇和甲醇均为分析纯。

岛津GC-2014AF气相色谱(GC)仪，配有Rtx-5型石英毛细管色谱柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μmol/L)，FID 检测器，日本岛津仪器有限公司；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪，美国安捷伦公司；S3400-I型扫描电子显微镜(SEM)，日本日立公司；Eclipse E200生物显微镜，日本尼康仪器有限公司；LD-UPW-V超纯水制备仪，上海砾鼎水处理设备有限公司；AB135-S十万分之一电子天平；FZ102型植物粉碎机；TGL-16B高速离心机。

1.2 油樟叶的采集

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li)，树龄为10年，在四川省宜宾市翠屏区思坡镇会诗村随机选择10棵树作为样株，分别于春季(2019年5月)和秋季(2019年11月)采集叶样。每次采样时，在每棵样株的东、西、南、北不同方位分别等量采摘，并充分混合，作为试验用叶样[10]。

1.3 油细胞形态研究

1.3.1光学显微镜测量 在油樟叶片中下部且无叶脉处，剪取5 mm×5 mm的样本，浸泡在5%的氢氧化钠水溶液中，在65 ℃恒温箱内放置48 h，取出后先用水冲洗2次，然后于双氧水中浸泡15 min，最后取出样本置于载玻片上，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。尽快使用生物显微镜对处理好的样本进行观察和拍摄，在10倍视野下拍摄样本，并记录油细胞数目作为该样本中油细胞的密度，在40倍视野下借助Image View软件中的测量工具对油细胞直径进行测量[11]。

1.3.2扫描电镜分析 在油樟叶片中下部且无叶脉处，剪取2 mm×10 mm的样本，立即投入电镜固定液(2.5%的戊二醛水溶液)，抽气至样本沉底，在室温环境下固定2 h，经过冷冻干燥后，放入离子溅射仪中，在5 Pa的真空度、30 mA的电流下喷金镀膜30 s。使用扫描电子显微镜对处理好的样本进行观察和拍摄[12]。

1.4 油樟精油的提取及成分研究

1.4.1精油的提取 将油樟叶片适度粉碎，碎片约5 mm×5 mm，准确称量40 g粉碎后的叶片放入蒸馏器中，连接好挥发油提取器，开始加热蒸馏，待挥发油提取器中有冷凝水流出开始计时，5 h后停止加热，收集上层精油，并精确称质量，在2～8 ℃冰箱内保存备用。针对两种试验用叶样分别进行3次平行实验，以油樟叶片的干质量计算精油的提取得率。

1.4.2GC-MS分析 将提取所得油樟精油样品用乙醇稀释5倍，使用0.45 μm滤头过滤，采用GC-MS分析其化学成分和含量。GC-MS分析所采用的气相条件：色谱柱为Rtx-5石英毛细管柱；载气为He，1.6 mL/min；进样口温度为280 ℃；进样量为0.2 μL；分流比为100 ∶1；色谱柱升温程序为50 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升至280 ℃保持20 min。质谱条件：EI电离源，电离源温度为230 ℃，电子轰击能量为70 eV，扫描质核比(m/z)范围为50～500。

1.4.3GC分析 分别精密称取1,8-桉叶素、α-松油醇和γ-松油烯3种对照品，用乙醇配制成约120 g/L的对照品母液。各取100 μL的3种对照品母液混合，得到各对照品质量浓度约为40 g/L的混合对照品母液，梯度稀释至约0.05、1、5、10和20 g/L，膜过滤以供GC测量分析，以对照品浓度为横坐标，GC峰面积为纵坐标绘制标准曲线。精密移取提取所得油樟精油样品，用乙醇稀释40倍，微孔滤膜过滤以供GC测量分析。GC分析采用GC-MS分析时所使用的气相条件。

1.5 油樟精油抗氧化活性研究

1.5.1总抗氧化能力 用无水乙醇将提取所得油樟精油样品配制成不同质量浓度梯度(0.01～10.00 g/L)的待测液，按照总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒说明书进行操作。在520 nm 测定样品吸光度，以抗坏血酸(Vc)溶液为阳性对照，以无水乙醇作为空白对照。在37 ℃时，每毫升样品使反应体系的吸光度值每分钟增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位，由此计算油樟精油的总抗氧化能力(U/mL)[13]。

1.5.2DPPH自由基清除能力 用无水乙醇将提取所得油樟精油样品配制成不同质量浓度梯度(0.01～10.00 g/L)的待测液，取不同质量浓度的待测液0.5 mL，加入0.5 mL DPPH乙醇溶液，混匀室温放置30 min，测定517 nm处的吸光度，以Vc溶液为阳性对照，以无水乙醇作为空白对照。根据公式计算油樟精油的DPPH自由基(DPPH·)清除率[14]。

式中：ηDPPH·—DPPH·清除率，%；At—样品吸光度；A0—空白吸光度。

1.6 数据处理

实验数据以平均值±标准偏差表示，平行实验≥3次，并使用SPSS19.0软件进行方差分析和检验。

2 结果与讨论

2.1 油细胞差异分析

a.春季spring，×10；b.春季spring，×40;c.秋季autumn，×10；d.秋季autumn，×40图1 油樟叶片中油细胞形态Fig.1 Oil cell morphology in leaves of C.longepaniculatum

2.1.1油细胞形态 图1(a)和(c)为普通光学显微镜10倍视野下所拍摄的春秋两季油樟叶片中油细胞的形态。由图可知油樟叶片中的油细胞以单个的形式分布于薄壁组织中，大多数分布在脉间区，少数分布在脉上，因此油细胞与其他组织细胞相比较，在分布形式上具有明显的区别[15]。随机挑选3张10倍视野下拍摄的照片，并统计该视野下油细胞的数量，结果表明：春季和秋季油樟叶片的油细胞密度分别为(41±3)和(38±2)个/mm2，说明春季油樟叶片中油细胞密度偏大。图1(b)和(d)为普通光学显微镜40倍视野下所拍摄的油樟叶片中油细胞的形态，由图可知油细胞为圆形或椭圆形。随机挑选1张40倍视野下拍摄的照片，并测量该视野下油细胞的直径，结果表明：春季和秋季油樟叶片的油细胞直径分别为(51.87±1.64)和(36.89±2.64) μm，说明春季油樟叶片中油细胞直径偏大。推测是春季油樟叶光合速度较快，吸收营养物质的能力较强，进而促进了油细胞的形成和增长。

2.1.2亚细胞结构 图2(a)和(d)为分别为春秋两季油樟叶片中油细胞的SEM图，在2 000倍视野下可以观测到油樟叶片中油细胞为椭圆球，细胞边缘明显，与光学显微镜的观测结果一致，随机选择2处油细胞的边缘位置放大至20 000倍，在超微水平上进一步观察油细胞的细胞壁结构，如图2(b)、(c)、(e)和(f)所示。

春季spring：a.×2 000；b.×20 000；c.×20 000秋季autumn：d.×2 000；e.×23 000；f.×21 000图2 油樟叶片中油细胞的SEM照片Fig.2 SEM images of oil cell in C.longepaniculatum leaves

由于图中细胞壁仅有初生纤维素壁层，初步推断采集的叶片样本中油细胞均尚未发育成熟[16]，可能处于细胞发育的第一阶段。图1(b)和1(d)所拍摄的油细胞尚未呈现为一个大油囊，细胞质尚未完全解体，属于油细胞发育第一阶段的特征。因此，图2(b)、(c)、(e)、(f)和图1(b)、(d)的拍摄结果相互验证，均表明本研究所采集的春季和秋季油樟叶中油细胞均处于细胞发育的第一阶段。春秋两季细胞壁厚度的平均值分别在1.65和0.63 μm左右，说明春季油樟叶油细胞在细胞发育第一阶段的细胞壁厚度大于秋季油樟叶，可能与春季油樟叶光合速度较快有关。

2.2 油樟精油提取得率及成分分析

2.2.1油樟精油提取得率 分别计算春季和秋季油樟叶扣除水分后的油樟精油提取得率，结果表明：春季和秋季油樟叶的精油提取得率分别为4.45%和3.09%。所采集的油樟叶中油细胞处于细胞发育的同一阶段，但是春季油樟叶油细胞密度和细胞直径均大于秋季油樟叶，这可能是导致春季油樟叶精油提取得率高于秋季油樟叶的重要原因。

2.2.2油樟精油化学成分 将春季和秋季油樟叶提取所得精油进行GC-MS分析，通过NIST标准质谱库以及PubMed数据库，共鉴定出16个化学物，利用峰面积归一化法计算各化合物的含量，最终结果见表1。由表1可知，春秋两季所采集油樟叶精油的主要化学成分相同，1,8-桉叶油素为含量最高的成分，相对峰面积超过50%，在秋季油樟叶中含量高。α-松油醇相对峰面积超过20%，在春季油樟叶中含量高。β-水芹烯相对峰面积超过5%，在春季油樟叶中含量高。其他相对峰面积超过1%的化合物分别是β-蒎烯、4-松油醇和γ-松油烯，均在秋季油樟叶中含量高。

表1 不同季油樟叶的精油成分Table 1 Volatile compounds identified in C.longepaniculatum leaves essential oil from different seasons

2.2.3油樟精油主成分含量 为了进一步精确地比较春秋两季油樟精油主要成分的含量，借助GC对其进行准确测定。首先利用GC对1,8-桉叶素、α-松油醇和γ-松油烯对照品所配制的标准溶液进行测定，以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标绘制出3种对照品的校正曲线，结果见表2。

表2 GC测定主要成分含量结果Table 2 The contents of main compounds measured by GC

3条校正曲线的校正系数均≥0.999，在相应的定量范围内可用于样品中主要成分的含量计算。计算结果表明：3个主要成分在油樟精油中含量顺序由大到小为1，8-桉叶素>α-松油醇>γ-松油烯，其中1，8-桉叶素和γ-松油烯在秋季精油中略高，α-松油醇在春季精油中略高，这与GC-MS峰面积归一化法计算结果一致。对3次测量结果分别进行差异显著性分析，结果表明T检验的P值均大于0.05，3种主要成分在春秋两季油樟精油中的含量没有显著性差异。

2.3 油樟精油抗氧化活性分析

2.3.1总抗氧化能力 春秋两季油樟叶提取所得油樟精油及Vc在不同质量浓度时的总抗氧化能力见图3(a)。由图可见，2种油樟精油的总抗氧化能力都随着溶液质量浓度的增加先增强而后趋于稳定，与Vc总抗氧化能力随质量浓度变化的趋势相同。春秋两季油樟叶提取所得油樟精油的总抗氧化能力在溶液质量浓度为0.8～2.0 g/L时达到最大，分别为6.50和5.50 U/mL，约等于Vc总抗氧化能力的40%，其中春季油樟叶提取所得油樟精油总抗氧化能力略高。

2.3.2DPPH·清除能力 随着油樟精油和Vc的质量浓度增加，各种物质对DPPH·的清除率均表现为先增加最后趋于稳定(见图3(b))。当质量浓度低于1.0 g/L时，油樟精油的DPPH·清除能力随质量浓度的增加而逐渐增加。计算各物质的IC50值，春秋两季油樟叶提取所得油樟精油的IC50均为0.2 g/L。由此可知，油樟精油在清除DPPH·方面具有较好活性，并且两种油樟精油的清除DPPH·自由基能力基本没有差异。

a.总抗氧化能力total antioxidant capability;b.DPPH·图3 油樟精油的体外抗氧化性能Fig.3 The in vitro antioxidant properties of C.longepaniculatum essential oil

3 结 论

3.1利用光学显微镜和扫描电镜对春秋两季油樟叶中油细胞的形态进行差异分析。结果表明：春季油细胞的细胞密度、细胞直径和细胞壁厚度均大于秋季油细胞。

3.2春季油樟叶的油樟精油提取得率高于秋季叶，GC-MS的鉴定结果表明春秋两季油樟精油主要成分均为1，8-桉叶素、α-松油醇和γ-松油烯。1,8-桉叶素和γ-松油烯在秋季油樟精油中的含量略高，α-松油醇在春季油樟精油中含量略高。

3.3春秋两季的油樟精油抗氧化能力与溶液浓度有较强的相关性，溶液质量浓度为0.8～2.0 g/L时达到最大，约等于Vc总抗氧化能力的40%，春季油樟精油总抗氧化能力略高。春秋两季油樟精油在清除DPPH自由基方面具有较好活性，IC50均为0.2 g/L，基本无差异。