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同轴骨组织工程支架降解特性研究

2021-03-05张钟毓张旭婧海几哲

机械设计与制造 2021年2期
关键词:丝素聚乙烯醇同轴

张钟毓,许 燕,2,张旭婧,海几哲

(1.新疆大学机械工程学院,新疆 乌鲁木齐 830046;2.西安交通大学机械工程学院,陕西 西安 710049)

1 引言

骨结核病是医学上的一大难题,传统结核药物标准化治疗往往持续至少(8~20)个月,包括清创手术及修复骨缺损[1]。这种治疗方法存在如下弊端:抗结核药物在到达病灶区后难以长期维持有效杀菌浓度;长期全身服用或注射极易引发毒副作用损害其他器官;清创后造成大段骨缺损。

针对以上问题,利用负载抗结核药物的骨组织工程支架治疗骨结核病应运而生。其不仅可针对病人个性化用药,而且对全身毒副作用小。文献[2]以PLGA 复合β-TCP,采用共混法载入抗结核药物制备得到的复合支架可有效抑制结核菌的生长增殖,置入骨结核病灶中起到局部抑菌的效果。文献[3]以聚乙烯醇为粘结剂,通过三维打印技术制备出了负载塞米松的支架,研究发现此种支架增强了生物活性和药物输送性能。文献[4]利用3D 打印技术制备了PLLA 多层同心圆柱载药人工骨,实现了药物逐序释放并交替出现浓度高峰。但因为所使用的材料单一,生物活性较差,不能较好地修复病灶区域的骨缺损。

因羟基磷灰石是人体和动物骨骼主要无机成分,对骨生长有诱导作用,可促进骨组织缺损的修复[5-6]。故用羟基磷灰石作为生物骨组织工程支架基体材料。聚乙烯醇作为一种极安全的高分子粘结剂,对人体无毒,生物相容性良好,其水凝胶具有与人体自然组织相近的含水量、较高的机械强度及多孔网络结构等特点,在生物医学中被广泛应用[7-8]。丝素蛋白作为一种天然纤维蛋白,是一种很理想的药物载体,具有良好的生物相容性及柔韧性[9-11]。基于此,以羟基磷灰石/聚乙烯醇为外壳支撑材料、羟基磷灰石/聚乙烯醇/丝素蛋白为内芯药物载体材料利用3d 打印技术制备出同轴梯度三维网格结构骨组织工程支架,并进行了体外模拟降解实验,对药物载体材料的生物力学性能进行测试和表征

2 实验部分

2.1 实验原料与设备

40nm 羟基磷灰石(南京埃普瑞纳米科技有限公司);聚乙烯醇(北京博奥拓达科技有限公司);350nm 丝素蛋白(湖州新天丝生物技术有限公司);无水氯化钙(天津大茂化学试剂厂);透析袋(北京索莱宝科技有限公司);SU8010 Scanning Electron Microscope(日本);伺服控制拉伸试验机(WDW-20);型号CX2000 电子天平(东莞长协电子);电热恒温干燥箱(绍兴市苏珀仪器有限公司);电热恒温培养箱(北京欧尼斯科技发展有限公司);三维交流伺服闭环数控平台(GXYZ353535VP、中国深圳);pH 测试笔酸度计(上海普禾电子有限公司)

2.2 聚乙烯醇/丝素蛋白复合水凝胶及聚乙烯醇水凝胶的制备

使用电子天平称取12g 聚乙烯醇(PVA)晶体,向其倒入100ml蒸馏水,通过水浴加热法制得聚乙烯醇凝胶。取5g 丝粉加入到50ml40%氯化钙溶液中,水浴加热直到无固体颗粒。使用去离子水透析SF/CaCl248h,得到SF 溶液后于4 摄氏度下冷藏。量取一定量SF 水溶液和PVA 水凝胶,按质量比1:4 进行混合后得到聚乙烯醇/丝素蛋白复合凝胶[12]。

2.3 复合材料支架的制备

以40nm 的羟基磷灰石粉末(HA)为基体材料,按质量比1:1.5 注入PVA/SF 复合凝胶,在瓷质捣药碗中混合、搅拌均匀后,将其取出装到内层针筒中,喷头直径尺寸0.6mm;按上述方法配制HA/PVA 高粘度复合材料,并装到外层针筒中,喷头直径尺寸1.55mm。利用G 代码操控三维工作平台运动轨迹,结合活塞挤出式沉积成型技术,通过自制喷头制得3 组十字网格结构的同轴生物多孔骨组织工程支架[13],尺寸为(15×15×10)mm。并按上述方法制备出同种规格的单轴HA/PVA、HA/PVA/SF 骨组织工程支架作为对照组。

图1 同轴组织工程骨支架Fig.1 Tissue Engineering Bone Scaffold

2.4 体外模拟降解实验

通过对支架进行编号,将各组支架依次放入锥形瓶中,向瓶内倒入初始pH=7.4 的PBS 缓冲液,如表1 所示。将其移入恒温培养箱中,调目标温度至37℃,不换液,模拟支架在体液中的降解,隔2、4、6、8、10 周后观察实验现象,记录、分析各项指标变化,对羟基磷灰石/聚乙烯醇/丝素蛋白同轴生物多孔骨支架降解趋势进行实验探究,得到药物载体材料降解性能的实验数据。

表1 PBS 缓冲液成分Tab.1 Composition of the PBS

3 结果与讨论

3.1 pH 分析

HA/PVA 复合材料在(0~2)周内,缓冲液pH 无变化,如图2所示。降解4 周后,缓冲液PH 值为7.3,而后又趋于平缓。降解10周后pH 值达到7.1,仅下降了0.3 单位,整体变化不明显,基本维持生理pH 值。随着HA/PVA/SF 复合材料在PBS 缓冲液中浸渍时间的增加,缓冲液,pH 值最终下降到6.6,变化最显著。浸润同轴复合材料的缓冲液pH 始终介于两者之间。随降解时间延长pH 值下降均匀,至第十周pH 值为6.8,呈弱酸性。实验过程中发现随时间增长降解液的颜色由透明变为淡黄色,并逐步加深,因丝素中含有羧基等极性基团,故推测丝素蛋白的不断析出致使溶液pH 值有所下降。研究表明细胞活性和细胞增殖均随pH 降低呈递减趋势,持续局部过酸条件会影响成骨细胞活性,抑制骨细胞增殖[14]。故降解过程中同轴复合材料骨组织工程支架较单轴HA/PVA/SF 材料酸碱度理想,无过酸过碱物质析出,不影响细胞正常增殖。

图2 浸润两组复合材料的降解液pH 随降解时间变化曲线Fig.2 pH of Degradation Solution Infiltrating Two Composites vs Degradation Times

3.2 高倍SEM 分析

在新疆大学理化中心进行高倍扫描电镜试验。将各组骨组织工程支架磨成粉末状,牙签蘸取少量通过导电胶粘到铜台上,进行喷金处理后,在5k 放大倍数下观察各样本微观结构。截取了三种骨组织工程支架在0、4、8、10 周的电镜图片,如图3 所示。

图3 高倍SEM 组织工程骨支架微纳米颗粒形貌Fig.3 Morphology of Micro and Nano Particles in Tissue Engineered Bone Scaffolds of High Power SEM

HA/PVA 复合材料骨支架在降解(0~4)周内微观形貌发生显著变化,降解前结构致密,降解4 周后出现微孔结构,这将为成骨细胞黏附、生长提供空间。10 周后羟基磷灰石复合材料呈棒状,微孔结构明显增多,孔径尺寸增大。HA/PVA/SF 复合材料骨支架在经4 周降解后,呈多孔海绵结构,材料表面出现更多细微孔隙。(4~10)周内孔洞数量随降解时间延长不断增加,相对HA/PVA复合材料各孔隙分布更均匀,从而更有利于新骨的长入,并为后期体内植入修复骨缺损提供基础。同轴梯度骨组织工程支架在降解4 周后,边缘区相对中心产生更多细微孔隙,外壳材料相对内芯材料降解更明显,说明内芯中含有的丝素蛋白材料可延缓降解。而在降解8 周后,可看到外壳和内芯搭载处出现多处微孔结构,推测由于初期外壳材料表面微孔结构增多降解加快,模拟体液从外壳材料逐步向内层渗透,因而交接处出现更多细微孔隙,这也说明同轴骨组织工程支架微孔结构具备一定连通性。在降解后期,内芯HA/PVA/SF 材料多处出现孔隙,说明模拟体液已渗入到内芯材料,这将为后期内芯材料负载的药物持续长久释放提供可能。

3.3 降解率分析

对三组复合材料骨组织工程支架依次编号,利用电子天平对各支架做三次平行称重实验,分别计算平均值记为其初始质量m初始。每2、4、6、8、10 周后,取出浸于降解液的两组复合材料支架,用滤纸吸干表面多余水分,并置于鼓风箱中进行干燥至恒重,并按前面方法进行称重、计算,所得数据记为降解后质量m 实验后。则计算不同复合材料生物组织工程支架降解率可用公式α=(m初始-m降解后)/m 初始×100%求得。

图4 复合材料骨组织工程支架降解率曲线图Fig.4 Mass Loss Rate of Different Composites vs Degradation Times

HA/PVA 复合材料生物骨组织工程支架降解2 周后,材料降解速率是10.05%,随着降解时间延长,6 周后降解率达到26.2%。(6~8)周内降解速率明显增快,这可能是由于随着降解时间的积累,材料表面孔隙累计增多从而加速了支架的降解。最终在降解10 周后,HA/PVA 复合材料骨组织工程支架降解率达到40.14%。

HA/PVA/SF 复合材料生物骨支架降解率随降解时间延长呈缓慢均匀增加的趋势。降解2 周后降解率为7.26%,10 周后降解率24.44%,同步对比HA/PVA 复合材料,复合丝素蛋白后降解率数值明显减小,降解变得缓慢。而研究表明丝素蛋白分子链中存在许多氨基酸重复多肽片段,其结构规整,通过氢键作用紧密地堆积形成了稳定的反平行β-折叠构象[15-16]。故推测丝素蛋白特有的稳定结构是导致复合材料骨组织工程支架降解速率变缓的重要因素。

同轴梯度复合材料生物骨组织工程支架在(0~2)周内降解率为9.52%,与HA/PVA 复合材料骨组织工程支架降解速率基本一致,说明此时降解主要发生在支架外壳表层。而后随着表面孔洞增多,加快支架表面的降解过程。降解6 周后,速率变缓,推测此时缓冲液已渗透到外壳和内芯搭载处,由于降解更易发生于规整性较差区域,而复合丝素蛋白后材料微孔结构分布更均匀,因此使得复合材料降解速率得到控制。10 周后降解率达到28.15%,与单轴HA/PVA/SF 降解率值相差不大,说明此时降解主要发生在内芯载体材料。临床研究发现,不同年龄、伤患部位的骨缺损患者骨愈合周期长短不一,时间范围为植骨手术后(4~9)个月。

由于骨愈合周期较长,成骨速度慢,且作为药物载体材料,应使药物缓慢均匀地释放来保证病灶区域长期维持一定杀菌浓度,因此复合材料骨组织工程支架降解速率不宜过快,否则影响骨结核患者术后恢复,所以包裹着含丝素蛋白材料的同轴骨组织工程支架降解速率更理想。

3.4 力学性能分析

将三组骨组织工程支架经2、4、6、8、10 周降解后取出,擦干表面多余水分,并冷冻干燥至质量不发生变化。在常温环境下利用新疆医科大学提供的伺服控制拉伸试验机进行非金属压缩试验。施加载荷的速度为0.5mm/min,借助微机控制电子万能试验机测控系统得到其试验力-变形曲线。抗压强度计算公式如下

式中:p—抗压强度;P—破坏时的最大载荷;A—样本试验接触面面积。结果如图5 所示。

图5 复合材料骨组织工程支架抗压强度曲线图Fig.5 Compressive Strength of Composite Materials vs Degradation Times

HA/PVA 骨组织工程支架在降解前的抗压强度为34.82MPa,随着在PBS 缓冲液中降解时间延长力学性能逐渐降低。降解10周后抗压强度减小为18.63 MPa。HA/PVA/SF 复合材料骨组织工程支架在经过10 周降解后,抗压强度变为7.91 MPa,在三组中力学强度最差。同轴复合材料骨组织工程支架相比于HA/PVA/SF材料,因外层使用了HA/PVA 复合材料,支架抗变形能力有所提高。降解4 周后抗压强度衰减率明显变大,这是由于降解主要发生于支架表面,外壳材料孔洞增多,导致力学性能显著变差。降解6 周后,力学性能衰减速率变小,这是由于在降解中期,外壳材料保护作用逐渐变弱,使得更多缓冲液接触到内芯材料。而在外壳复合材料基础上添加了丝素蛋白作为内芯材料后,其微观形貌更规整,微孔结构分布更加均匀,这种现象将延缓复合材料降解速率,使支架材料抗变形能力衰减速度趋于平缓。因骨组织替代材料需满足人体松质骨抗压强度4-13MPa,同轴骨组织工程支架在降解终期的抗压强度为12.61MPa,仍在此范围内,说明在药物载体材料降解过程中同轴梯度骨组织工程支架可满足力学支撑条件。

4 结论

(1)SEM 分析结果表明,同轴复合材料骨组织工程支架随着降解时间的延长孔洞数量不断增多,这将有利于成骨细胞黏附、增殖,并提供新骨生长的空间。降解10 周后,溶液呈弱酸性,整个过程无过酸过碱物质产生,可提供细胞正常增殖的微环境。

(2)与单轴羟基磷灰石/聚乙烯醇骨组织工程支架相比,由于内芯药物载体材料复合了具有稳定β-折叠构象的丝素蛋白,同轴支架降解速率明显变得缓慢,这可为后续药物随载体材料降解而长期持续释放提供理论基础。

(3)相比于单轴羟基磷灰石/聚乙烯醇/丝素蛋白复合材料,同轴复合材料骨组织工程支架因羟基磷灰石/聚乙烯醇表层材料赋予了其更优异的力学性能,基本满足松质骨抗压强度要求,可为后期体内植入提供参考依据。但体外模拟的环境终究和体内存在差别,因此同轴骨组织工程支架体内降解性能仍需考察。

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