付伟超，安崇佑，任彦松，孙 静，文亚男，张 森，于文颖，梁昊岳*

（1.中国医学科学院血液病医院，中国医学科学院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，天津300020；2.天津市中心妇产科医院，天津300052）

0 引言

近年来，流式细胞仪获得了突飞猛进的发展。目前，流式细胞仪的发展趋势是多激光多色、小型化和高速分析分选等。此外，流式细胞仪聚焦原理多样化以及与其他生物学技术密切结合也是流式细胞仪发展的一大特色，既可以帮助研究者分析细胞的大小和颗粒度等物理参数，又可以帮助研究者分析细胞周期及其增殖、凋亡和表型变化等化学性质[1]。因此，流式细胞仪在免疫学、肿瘤学、血液学等科学领域的应用日益广泛[2-5]。如以BD Influx和BD cantoⅡ为代表的应用流体力学原理设计的传统流式细胞仪和其他基于新技术设计的新型流式细胞仪在科学研究领域都发挥着重要作用。虽然在传统流式细胞仪的基础上发展出了基于声波聚焦原理的Attune®流式细胞仪、基于微毛细管技术的Guava easyCyte系列流式细胞仪、将流式细胞检测与显微成像相结合的FlowSight显微成像流式细胞仪、基于粗波分复用技术的Cytek Aurora全光谱流式细胞仪和采用金属元素标记物识别信号分子的CyTOF2质谱流式细胞仪等[6-8]，但是BD Influx和BD CantoⅡ流式细胞仪始终作为流式细胞分选和分析的高端机型被应用于科学研究。

完善的技术培训体系是大型仪器规范管理、维护仪器良好运行状态的基础，而良好的仪器状态又是支撑技术培训工作、开展科研实验的重要保障。二者息息相关，密切配合，共同为科研院所流式中心的正常运转奠定了坚实基础。且以技术培训和仪器维护为依托的流式中心平台正充分发挥着国家重点实验室科研技术平台的科研支撑、窗口展示和辐射周边院所的功能，为流式技术的提升、成果转化和人才培养贡献应有的力量。

本文结合科研平台流式细胞仪的运转情况，以BD CantoⅡ为例介绍检测正常人外周血naïve细胞和静息态T细胞的标准方法以及仪器校准、电压调节、荧光补偿调节等实验模板的建立流程，并以BD Influx为例分析流式细胞仪的结构与功能特点，重点介绍多色流式细胞术技术培训中实验模板建立、电压调节、补偿调节等相关内容，并对2010—2018年实验血液学国家重点实验室科研技术平台流式中心BD Influx流式细胞仪的使用记录进行统计分析，列举常见故障，并详细阐明引起故障的原因及处理方法，探讨流式细胞仪日常维护和专项技术培训一体化管理模式，旨在为相关仪器管理者和使用者提供借鉴。

1 流式细胞仪的结构与功能特点

流式细胞仪在生物学、医学、光学等领域有着广阔的应用空间。本文以BD Influx流式细胞仪为例，介绍流式细胞仪的结构及功能特点。BD Influx流式细胞仪可选择搭载1～5根激光器，支持FITC、PE、PE-Cy7、PercP、APC、APC-Cy7、Hoechst Blue、Hoechst Red等一系列荧光通道检测的需要；采用可完全更换的液路装置，充分保证了细胞活性，避免了菌类污染的发生。BD Influx是空气激发的流式细胞仪，其光路系统将激光直接照射到液流上，使光路调节十分方便、直观。且BD Influx流式细胞仪的光路之间互相独立，可独立完成调节和聚焦，以便从不同角度与液流相交形成空间立体。这种设计较好地避免了光信号经过石英杯流动室时所受到的干扰，为更好地提高流式细胞群比例和荧光强度检测的效率和稳定性奠定了坚实基础。

在上述仪器设计的基础上，BD Influx流式细胞仪的功能应用也较为广阔。BD Influx流式细胞仪不仅可用于完成细胞计数、细胞死活鉴定、荧光蛋白检测、细胞表型、核酸含量检测、线粒体活性、胞内钙离子、pH值、细胞增殖、药物摄取评价、细胞代谢、细胞凋亡、罕见细胞群检测、小颗粒检测等各种高通量流式细胞分析和分选实验，还可用于自发荧光种群的分析鉴定、未知荧光物质研究、环境和海洋生物学研究以及衡量荧光蛋白、荧光能量转移等方面。BD Influx流式细胞仪能够检测低至200 nm的颗粒，这种高分辨力的小颗粒检测功能对海洋生物学、微生物学和环境生物学的研究具有特殊的应用价值。

与此同时，在日常开展上述部分实验研究时发现，BD Influx流式细胞仪可以进行多荧光、多参数定量分析及无菌高速分选，具有消耗鞘液量少、分选速度快、分选后细胞活性高等特点。但对操作者技术要求较高，使用过程较为复杂，需要经过完整的培训和长时间的实践才能很好地掌握操作技术，完成细胞分析和分选。

2 流式细胞仪技术培训

2.1 材料和方法

2.1.1 仪器与材料

BD CantoⅡ三激光（405、488、633 nm）流式细胞仪，购自美国碧迪公司；CST质控微球，购自美国碧迪公司；PE标记的抗人CD3抗体、FITC标记的抗人CD45RO抗体、PerCP-Cy5.5标记的抗人CD45RA抗体、PE-Cy7标记的抗人CD4抗体、APC标记的抗人CD25抗体、APC-Cy7标记的抗人CD8抗体、BV510标记的抗人CD127抗体等带有荧光素的单克隆抗体，购自美国碧迪公司；DAPI染料，购自美国Sigma公司；红细胞裂解液（ACK），购自北京索莱宝科技有限公司。

2.1.2 方法

2.1.2.1 仪器质控

取0.5 mL去离子水至5 mL流式管中，滴入2滴CST质控微球，制成质控试剂溶液。进入Diva软件在Cytometer下进入CST质控系统，将与所购CST质控微球批次相同的批次文件导入CST质控系统后，执行Baseline。BD CST质控微球可提供特定的信息，通过Diva软件的解读可从这些信息中得出线性、背景噪声、电子噪声和检测效率等方面的信息。且这些微球能够评估流式细胞仪的运行状态，以便根据收集到的不同参数确定最佳激光延迟设置。

2.1.2.2 多色流式样本制备

多色演示实验共分为3组，分别设置阴性管、单阳对照管和实验样本管。其中，设置阴性管1个，只加入细胞，不加任何单克隆抗体或DAPI染色液，用于演示鉴定阴性和阳性细胞群体；单阳对照管8个，每管只加入1种单克隆抗体或DAPI染色液，用于演示调节各荧光素之间的荧光溢漏；实验样本管1个，加入全部单克隆抗体和DAPI染色液，用于演示对各类T细胞分型。取健康人新鲜外周血，裂解红细胞后，将所得细胞平均分成10份，分别加入到对应的阴性管、单阳对照管和实验样本管。阴性管可不做处理备用，单阳对照管和实验样本管分别使用对应的流式抗体染色，避光孵育30 min后用3 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞，离心并去除上清液后用适量PBS重悬细胞，避光备用。

2.1.2.3 多色流式培训演示

多色流式细胞术实验模板的建立需要保证各荧光通道电压合适以及各荧光素通道之间的荧光补偿准确。在演示多色流式细胞术实验模板建立流程时，首先使用实验样本管调节各通道电压，将阴性群和阳性群调至合适位置。电压设定的原则为对低表达的群体有着良好的分辨力，阳性群荧光信号不能超出线性范围。一般控制阴性群在103以内，阳性群位于103～104，可根据实际情况微调，有相互补偿的两荧光通道电压数值尽量不要相差过大。确定电压后不再更改，依次上样各荧光抗体单阳对照管，记录数据后调节补偿大小。补偿调节遵循横平竖直的原则，各单阳对照管调节补偿方法一致，演示以PE单阳对照管为例，PE单阳对照管中阴性群和阳性群在其他荧光通道的荧光值中位数应当一致。补偿调节时，单阳对照管调节补偿的办法为画出双指数显示方式的散点图，固定横坐标为单阳对照管所带荧光，依次切换纵坐标，将阴性群和阳性群的细胞荧光中位数调成一致，以此办法调节每个单阳对照管补偿。上样阴性管，记录数据，与阴性管荧光信号一致的群体为阴性群，高于阴性管荧光信号的群体为阳性群。最后，上样实验样本管，记录数据，得到标准实验结果，即多色流式细胞术实验模板建立完成。在流式细胞仪稳定状态下，本演示实验中建立的电压、补偿参数数值可用于后期实验的参考。

2.2 结果

2.2.1 仪器质控报告

CST质控系统运行过程中可实时显示蓝激光器、红激光器和紫激光器下微球的信号状态，如图1所示。质控结果显示，流式细胞仪状态良好，可以进行流式分析实验。

2.2.2 荧光通道补偿调节结果（以CD3-PE单阳对照管为例）

图1 CST质控实时图

全阳管上样后各通道信号参差不齐，部分压线，部分聚集在左边，阴性群和阳性群区分不明显。通过调整各通道的电压值，使得细胞群在流式图中处于合适的位置。多色流式细胞术结果显示所有收集到的荧光信号，包括细胞信号和碎片信号。与细胞碎片不同，完整的细胞形态较大，前侧向荧光信号较强，如图2（a）所示，图中红色部分为细胞群体。图2（b）中显示了圈选细胞群后的CD3-PE通道，调整光电倍增管电压使阴性群处于103个以内，阳性群处于103～104个，细胞群整体分布合适。

以CD3-PE单阳对照管为例，调节PE和PerCPcy5.5之间的荧光补偿。补偿未调节时，PE单阳细胞群的荧光信号会溢漏至PerCP-Cy5.5通道，PE单阳群在PerCP-cy5.5通道出现假阳性信号，该群体会被误认为是PE和PerCP-cy5.5的双阳性细胞群，从而影响细胞群的比例判定，如图2（c）所示。补偿调节后，阴性细胞群和单阳细胞群2个群体在水平方向上密度中心处于平行状态，阳性细胞群不再向右上倾斜，PerCP-Cy5.5不再出现假阳性信号，表示荧光补偿调节适当，如图2（d）所示。

图2 多参数流式模板调节示意图

2.2.3 人外周血T细胞流式分析结果

电压和荧光补偿调节完成后，上样实验样本管，不做任何改动，直接记录数据，逐级圈门，得到目标细胞群比例。健康人外周血T细胞根据表面抗原的不同，可分为不同功能的T细胞。本研究中利用CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RO、CD45RA共7个经典抗原和DAPI染料对健康人外周血T细胞中的effective Tregïve Treg进行鉴定。

首先通过DAPI染料在CD3、CD4、CD8、CD25和CD127中鉴别出人外周血Treg细胞（如图3所示），其表型为DAPI-CD3+CD4+CD8-CD25+CD127low，结果中Treg流式图形较为典型。Treg细胞可根据CD45RO和CD45RA两种标记物进一步分为naïve Treg和effective Treg，如图3（f）所示。其中，naïve Treg表型为CD45RO-CD45RA+，effective Treg表型为CD45RO+CD45RA-，2种细胞分别占Treg细胞的比例分别为16.4%和68.8%，如图3（g）所示。图4展示了人外周血样本流式分析中各通道荧光的表达情况，阴性群、阳性群的分布与经典的逐级圈门方式结果相符。

3 流式细胞仪的维护管理

3.1 技术培训过程中的常见故障案例

3.1.1 案例一

3.1.1.1 故障现象

液流启动异常。

3.1.1.2 故障分析与维修

此故障发生的原因可能有：（1）鞘液不足或鞘液桶未拧紧；（2）废液桶未拧紧；（3）喷嘴堵塞；（4）鞘液未充满液路。

全面观察BD Influx流式细胞仪（如图5所示），本着先易后难的原则逐个排查故障。（1）检查鞘液桶内鞘液是否不足，如不足则更换一桶新的鞘液并拧紧鞘液桶盖。（2）查看废液桶中废液是否过多，若废液过多则清空废液桶并拧紧废液桶盖。（3）取下喷嘴，使用超声仪将喷嘴超声清洗1～2 min后，使用无菌注射器沿液流相反方向冲洗喷嘴，然后再沿液流相同方向冲洗喷嘴，如果注射器打出的液流呈直线状，则喷嘴清洗完成。最后将喷嘴安装到细胞仪上并拧紧，确保O型圈密封良好。（4）在喷嘴孔下面放置冲洗槽，按Rinse键打开液流，30 s后关闭液流，反复开关几次，使鞘液充满液路。

对故障原因逐一进行排查后，液流正常启动。BD Influx流式细胞仪推荐使用型号为100μm的喷嘴，液流启动后鞘液压力为0.118 MPa、样本压力为0.125 MPa为宜，这样有利于保证液流的稳定性。

3.1.2 案例二

3.1.2.1 故障现象

Pinhole显示屏显示异常。

图3 人外周血T细胞流式分析图

图4 外周血T细胞流式分析小提琴图

3.1.2.2 故障分析与维修

图5 BD Influx流式细胞仪

此故障发生的原因可能有：（1）机器与计算机未成功连接；（2）喷嘴堵塞；（3）管路中存在气泡；（4）Pinhole未校准到最佳位置。

排除方法：（1）依次重新开启主电源、真空泵、空气压缩机、流式细胞仪的电子系统、计算机、激光开关、加压阀和FACS软件。（2）按要求超声清洗喷嘴。（3）执行反冲和排气泡操作，将排气泡贮水匙放置在冲洗槽上面，匙中装满无菌去离子水，使喷嘴的底部尖端没入液面以下。按“Purge”键使气泡随液流流走，当贮水匙中充满水后反复按“Purge”键数次。打开液流后，移开进样针位置处流式管，按“Backflush”键反冲30 s。（4）调节喷嘴上方的3个互相垂直的银色旋钮，经Pinhole显示屏观察，调节X轴旋钮使液流聚焦清楚，调节Y轴旋钮使液流移至Pinhole中央，Z轴不调。按可能原因逐一排查故障后，Pinhole显示屏显示正常。

3.1.3 案例三

3.1.3.1 故障现象

Stream显示屏显示异常。

3.1.3.2 故障分析与维修

此故障发生的原因可能有：（1）喷嘴堵塞；（2）液路内有气泡；（3）喷嘴未调到最佳位置。

排除方法：（1）按要求超声清洗喷嘴。为保证喷嘴不堵塞，分选的样本应在上样之前用300目滤网过滤，再进行分选实验。如需分选巨核细胞等较大细胞，应使用较大孔径的喷嘴（如100μm孔径喷嘴）以避免堵塞。使用BD Influx细胞仪进行分选时，样本浓度不宜超过107个/mL，上样速率不宜超过30 000 events/s。（2）执行反冲和排气泡操作。（3）调节喷嘴上方的2个互相垂直的黑色旋钮，经Stream显示屏观察，调节前后旋钮使喷嘴前后摆动，调节左右旋钮使喷嘴左右摆动。反复调节上述2套旋钮使喷嘴处于最优位置。对故障进行逐一排查，最终Stream显示屏显示正常，液流清洗稳定。

3.1.4 案例四

3.1.4.1 故障现象

分选后未得到目标细胞。

3.1.4.2 故障分析与维修

此故障发生的原因可能有：（1）振幅设置不当。振幅设置不当会导致目标细胞未进入收集管中，造成目标细胞损失。（2）Drop delay设置不当。Drop delay设置不当会造成目标细胞进入废液收集管，导致目标细胞损失。（3）偏转板上有液滴。偏转板上有液滴会造成振幅设置不当，分选后不能获得足够的目标细胞。（4）收集管或96孔板位置设置不当。

排除方法：（1）振幅优化。合上电偏转板，在Sort Layout窗口中Sort Mode选择“1.0 Drop Pure”，在Sorting Settings窗口中点击“Test Streams”，则可在Stream显示屏中见到测试液流分叉。若液流打在偏转板上或不能被废液收集器接收，可调节Maximum Drop Charge值，使液流分叉适当。若在Test Streams条件下测试液流分叉正常，可再调节Flash Charge，同上过程优化振幅。（2）重调Drop delay[9]。Drop delay数值的设定既影响细胞分选的得率，也影响分选的纯度。Drop delay数值如偏差较大，亮斑不明显，可加大Drop delay溶液浓度或加快上样速度，以便观察亮斑从右向左的变化过程。Drop delay调节完成后应尽快进行分选，如液流断点发生变化，应重新调节Drop delay。（3）用干燥、无菌棉签擦拭偏转板及附近区域，擦干后重新优化振幅。分选过程中如发现Stream显示屏中显示偏转板上有液滴出现，应及时结束分选，擦拭偏转板，重新优化振幅并重调Drop delay后再继续分选。（4）重启Sortware软件，依据收集管和96孔板位置调整偏转电压，使偏转液流打在收集管正中或96孔板每孔正中。BD Influx流式细胞仪Sortware软件界面如图6所示。对故障进行逐一排查后，显微镜下可看到目标细胞。

图6 BD Influx流式细胞仪Sortware软件界面示意图

3.1.5 案例五

3.1.5.1 故障现象

分选后细胞纯度不高。

3.1.5.2 故障分析与维修此故障发生的原因可能有：（1）Drop delay调节不当。Drop delay调节不当，导致机器对液滴加电不准确，目标细胞未完全进入收集管，同时部分非目标细胞被错误加电荷，使进入收集管分选后细胞纯度不高。（2）流式分选仪管路不洁净。流式分选仪管路不洁净造成目标细胞在通过管路时被污染或死亡，导致分选后所得细胞纯度不高。

排除方法：（1）准确调节设置Drop delay，具体过程见3.1.4.2。（2）完成BD Influx流式细胞仪无菌管路制备和流式分选仪月维护工作。使用无菌管路替换现有管路，并将鞘液桶装满75%酒精，冲洗管路，再用次氯酸钠溶液冲洗管路，最后用无菌水冲洗。经液路冲洗和准确调节Drop delay，分选后细胞纯度达98%以上。

3.2 需要厂家工程师现场解决的故障

本研究数据统计结果显示，2010—2018年BD Influx流式细胞仪共计维修22次。常见故障包括硬件损坏、参数调节、软件损坏、光路偏离、常规保养和其他故障等。22次维修的故障按故障发生分类和频次降序排列，如图7所示。

图7 BD Influx流式细胞仪故障分类图

3.2.1 硬件损坏

硬件损坏是BD Influx流式细胞仪在科研应用中出现频次最高的故障。硬件损坏主要包括压力传感器损坏、accudrop摄像头损坏、定时器电池损坏、放气阀损坏、压力表损坏、全套管路损坏、过滤器损坏、上样针损坏、喷嘴（70、100、140μm）损坏和密封圈损坏等。硬件损坏的原因包括操作不当、配件老化和短时间集中使用造成损耗等。

仪器操作者应充分了解BD Influx流式细胞仪的使用原理及其与常规石英杯流动室激发的流式细胞仪的区别，正确调节光路、液路（包括振幅、频率、液滴延迟等参数），规范操作流式细胞仪的参数调试和最佳使用条件的设定[10]。同时，应定期检查流式细胞仪的激光器、压力传感器、光纤、摄像头等重要配件工作状态，并将有效信息及时反馈给厂家工程师，以保证仪器良好的运行状态，降低仪器的故障发生率和维护维修成本。厂家工程师应定期、系统检查设备，进行专业化仪器维护保养和管路更换等操作。

3.2.2其他故障

BD Influx流式细胞仪其他出现频次较高的故障包括液流摄像头保护罩脱落、鞘液桶放气阀漏气、上样针堵塞、液流不稳、计算机无法启动和光路调节旋钮松动等。

排除方法：采取重黏液流摄像头保护罩、拧紧鞘液桶阀、疏通上样针、疏通或更换管路、重新插拔计算机内存条和固定光路调节旋钮等方法，在判断故障原因的基础上对因施策从而排除故障。

3.2.3 参数调试

在硬件未出现故障的情况下，因BD Influx流式细胞仪操作内容复杂而灵活，常会出现分叉不稳等情况，需要进行仪器及软件相关参数的调试。

排除方法：调节鞘液压力、振幅、频率、Drop delay等重要参数，保持仪器各方面状态的平衡。必要时，邀请厂家技术工程师现场调试，加强流式细胞仪的操作培训和技术交流，提升使用者的参数调试水平，从而保证BD Influx流式细胞仪能正常运行。

3.2.4 软件损坏

BD Influx流式细胞仪Sortware软件损坏会导致不能正常使用。软件损坏的原因主要是软件版本较低，需要及时更新。软件损坏的现象包括流式模板损坏、流式图显示异常、Acquire键不能点击等。排除方法：请工程师及时升级软件到最新版本。同时，应注意在使用BD Influx流式细胞仪时不得使用U盘拷贝数据，应将数据共享到另一台计算机上再进行数据拷贝，以保证软件不受病毒侵害。当操作者发现软件使用故障时，应及时保存已产生的实验数据，并通知流式技术平台管理员进行处理。管理员可尝试重装Sortware软件并按操作流程运行[11]，如仍无法正常使用，应及时请厂家工程师现场处理。

4 结语

流式细胞仪因其检测准确率高、灵敏度强、适合高通量细胞生物学检测，并与分子影像学等其他生物学技术的有机结合，已成为细胞生物学研究的重要手段[12-15]。完整的集理论、培训、上机实践和软件操作于一体的流式细胞仪技术培训和良好的仪器维护水平为科研工作的顺利开展奠定了基础。针对不同对象的分层级培训方式将在流式细胞仪使用技术培训中发挥更大的作用。以流式细胞仪三级培训为例，为初学者设计的一级培训侧重告知仪器使用过程中的禁忌，为初学者操作仪器做好警示规范工作；为有经验的研究人员设计的二级培训侧重高级分析技术的传授和分享；为仪器维护工作人员设计的三级培训侧重介绍仪器维护保养方面的知识和技巧。只有科学使用流式细胞仪并对其进行定期保养，才能为流式细胞技术规范化培训和科学管理提供保障，保证技术平台科学研究和研究生教育培养工作的顺利进行，减少仪器的故障率，降低维护成本，从而不断推进大型仪器技术进步。

随着流式技术的不断发展，流式细胞仪的配置越来越高，多色流式已成为检测细胞群或单细胞特征的趋势型技术。随着科研技术平台的发展，流式细胞仪数量越来越多，科研人员对仪器状态的要求越来越高。做好多色流式培训技术，将大大提升科研人员对流式技术的理解和实践能力，提升流式技术实验结果的准确度和可重复性。科研人员能够独立操作，对缓解流式中心仪器多、人员不足带来的问题有着显著的作用。因此，加强仪器维护，开展多色流式技术培训，将对提升整个流式中心技术服务水平产生较为积极的影响。