李艳花，闫亚平，刘晓琴，席国萍，宋国斌，肖保国，马存根，4

1. 山西大同大学脑科学研究所，神经炎症及变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室，大同037009；2. 陕西师范大学生命科学学院，西安710062；3.复旦大学附属华山医院神经病学研究所，上海200040；4.山西中医药大学国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室，神经生物学研究中心，晋中030619

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种好发于青壮年的中枢神经系统（central nervous system，CNS）自身免疫性疾病，在我国发病率逐年提高［1］。目前大部分药物只能暂时缓解症状，并不能达到治愈的目的。干细胞移植作为一项新的治疗方法，已经成为神经科学领域研究的热点［2］。有研究［3］将过表达趋化因子受体5（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）的神经干细胞，通过静脉给予实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠，发现CCR5能够增强神经干细胞向CNS炎症部位迁徙的能力。尽管表达CCR5的神经干细胞可以改善EAE的临床症状，但症状改善程度仍不理想［3］；可能是CNS的微环境特别是炎症细胞因子及神经再生抑制因子的存在，影响了外源性神经干细胞的存活、分化和内源性神经干细胞的动员，从而影响了疗效。我们的前期研究［4］显示，Rho激酶（Rho-kinase，ROCK）抑制剂法舒地尔（fasudil）具有减轻CNS炎症反应、抑制神经再生抑制因子信号通路、促进神经干细胞进入CNS 等作用，可提升神经干细胞对帕金森病模型小鼠的治疗效果。但fasudil联合过表达CCR5的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是否能够提升对MS的治疗效果，目前未见报道。本研究以小鼠EAE模型作为研究人类MS的动物模型，将fasudil 作为MSCs 移植的伴侣，探讨fasudil 联合过表达CCR5 的MSCs（CCR5-MSCs）对EAE 的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白第35～55位肽片段（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55，MOG35-55；Genscript，美 国），弗 氏 完 全 佐 剂（Sigma，美国），百日咳毒素（Enzo Life Sciences，美国），包埋剂（樱花，日本），抗神经巢蛋白（nestin）抗体、抗神经/胶质抗原2（nerve/glial antigen 2，NG2）抗体、抗甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氨 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Cell Signaling，美国），抗脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF） 抗体（Epitomics，美国），抗神经营养因子3（neurotrophin-3，NT-3）抗体、抗神经生长因子（nerve growth factor，NGF）抗体（Abcam，美国），抗胶质细胞源性神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）抗体（Epitomics，美国），辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠、抗兔、抗大鼠二抗（Thermo Scientific，美国），荧光素（Alexa Fluor®405、Alexa Fluor®647 和Alexa Fluor®594） 标 记 的二抗（Jackson ImmunoResearch，美国），聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美国），脱脂奶粉（BD，美国），化学发光试剂盒（Millipore，美国），透明质酸（Sigma，美国），fasudil（天津红日药业有限公司赠送），NheⅠ和NotⅠ限制性内切酶（Thermo Scientific，美国），慢病毒转染试剂盒、慢病毒滴度检测试剂盒（SBI，美国）。

1.1.2 主要仪器 低温高速离心机（Sigma，美国），荧光显微镜（Olympus，日本），酶标仪（BioTek，美国），超声波破碎仪（Wiggens，德国），SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及转印装置、化学发光成像系统、PCR 仪、流式细胞仪（Bio-Rad，美国）。

1.1.3 动物、菌株和细胞 8～9周龄雌性健康C57BL/6小鼠32只，体质量18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。生产许可证号SCXK（京）2019-0008，使用许可证号SYXK（晋） 2018-0002。结核分枝杆菌H37Ra（Difco，美国），人胚肾293TN细胞（SBI，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 EAE模型制备及动物分组 所有小鼠后颈部皮下注射0.2 mL MOG35-55乳化液（包含弗氏完全佐剂100 μL、MOG35-55300 μg、灭活的结核分枝杆菌400 μg），完成免疫。免疫当日和48 h 后，每只小鼠腹腔注射百日咳毒素250 ng。自免疫后次日开始进行小鼠体质量检测和临床症状评分。症状评分标准为国际通用5分评分制：0分，无症状；1分，尾部张力消失；2分，一侧后肢无力；3分，双后肢瘫痪；4分，被动翻身后不能恢复；5分，濒临死亡或死亡。动物饲养和处理符合山西大同大学动物伦理相关规定。

建模成功后，按体质量将EAE 模型小鼠随机分为EAE 模型组（腹腔注射生理盐水）、fasudil 干预组（腹腔注射fasudil）、CCR5-MSCs 干预组（鼻腔给予CCR5-MSCs）、fasudil 联 合CCR5-MSCs 干 预 组（鼻 腔 给 予CCR5-MSCs，并腹腔注射fasudil），每组8 只。CCR5-MSCs给予方法：在MOG35-55免疫后的第12 日，将CCR5-MSCs 干预组和fasudil 联合CCR5-MSCs 干预组小鼠麻醉后，手持小鼠使其鼻腔与颈部连线垂直地面，每鼻孔给予3 μL 透明质酸（含100 个活性单位）；之后缓慢给予12 μL CCR5-MSCs（细胞总数为1.5×105），期间允许小鼠主动吸入细胞悬液。fasudil给予方法：在MOG35-55免疫后的第14～27 日，fasudil 干预组和fasudil 联合CCR5-MSCs干预组腹腔注射fasudil 400 μg，每日1次。EAE模型组以同样方式给予生理盐水作为对照。

1.2.2 MSCs 获取 将小鼠无痛断颈处死，70%乙醇消毒，无菌条件下分离后肢，去除肌肉组织；于关节处断开股骨，5 mL注射器吸取4 mL培养液，从股骨一端吹出骨髓组织，清洗2次；37 ℃、5%CO2条件下，以含2%B27无血清添加剂、20 ng/mL表皮生长因子、20 ng/mL碱性成纤维生长因子的DMEM/F-12 培养液培养。按照1×106/mL的密度将细胞种植于25 mL培养瓶，每4 d换液1次。2周后，获取MSCs细胞球。细胞球经Accutase细胞消化液消化成单细胞悬液，1︰3 稀释传代，每3 d 传代1 次，直到第5～10代，细胞球被消化成单细胞用于转染。

1.2.3 载体构建及质粒获取 根据小鼠Ccr5 基因（NM_009917）的蛋白编码序列（coding sequence，CDS）设计引物，上游引物序列为5'-AAAGCTAGCATGGATTTTCAAGGGTCAGTTC-3'，下游引物序列为5'-AAAGCGGCCGCTCATAAACCAGTAGAAACTTCAT-3'。从反转录产物中，扩增得到Ccr5 的CDS，通过中间载体（pGEM-T）进行扩增和测序。随后通过NheⅠ和NotⅠ限制性内切酶将Ccr5 的CDS 连入表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-cop-GFP。使用质粒抽提试剂盒获取高纯度pCDH-CMVMCS-EF1-cop-CCR5-GFP质粒，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 慢病毒制备及转染 依据慢病毒转染试剂盒说明书操作，将293TN 细胞按照7×106～8×106/mL 的密度种植于15 cm 培养皿，培养18～24 h 待细胞达到60%～80%的融合度。将45 μL包装质粒混合液（pPACKH1）和4.5 μg目的质粒加入1.0～1.6 mL 无血清DMEM 培养液中，混匀，再加入55 μL转染试剂（PureFection），涡旋10 s，室温孵育15 min。将其均匀悬滴于293TN细胞培养液中，混匀，于培养箱中培养12～24 h 并换液。转染后48 h 和72 h 收集上清液到50 mL无菌离心管中，3 000×g室温离心15 min。转移上清液到250 mL离心管中，加入1/4体积预冷的慢病毒浓缩液（PEG-it Virus Precipitation），4 ℃冰箱中放置至少12 h。1 500×g、4 ℃离心30 min，收集慢病毒颗粒沉淀；同时收集上清液，1 500×g、4 ℃离心5 min，获得全部慢病毒颗粒沉淀。以1/100～1/10的比例重悬慢病毒沉淀于预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，分装后保存于-80 ℃冰箱中。使用慢病毒滴度检测试剂盒进行滴度测定。

将5×104MSCs 种植于24 孔板。次日，吸去培养液，补加500 μL 含2.5 μL 1×TransDux 溶液的培养液，按照不同感染复数加入慢病毒，以未转染的MSCs作为对照。转染后72 h，在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达情况。收集含有绿色荧光的细胞球，用于后续实验。

1.2.5 流式细胞术分析 CCR5-MSCs 细胞球经Accutase细胞消化液消化成单细胞悬液，PBS 洗1 次，4%多聚甲醛固定10 min，之后PBS 洗1 次。加入通透液稀释的抗nestin 抗体和抗CCR5 抗体，4 ℃冰箱内孵育过夜。PBS洗1 次后，加入荧光素（Alexa Fluor®405 和Alexa Fluor®647）标记的二抗孵育1.5 h，之后PBS 洗1 次，流式细胞仪检测nestin+CCR5+细胞数。

1.2.6 脊髓组织处理 于免疫后第28 日，向小鼠腹腔注射0.2 mL 0.3%戊巴比妥钠溶液，待成功麻醉后将其断颈处死。经心脏依次灌注40 mL 生理盐水和40 mL 4%多聚甲醛，分离脊柱，去除椎骨，2%多聚甲醛室温固定4 h。10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水各4 h，包埋剂包埋组织，于液氮中快速冷冻。冷冻切片机切片，厚度为10 μm，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.7 固蓝染色 冰冻切片经室温晾干后，放入固蓝（luxol fast blue，LFB）染色液中，57 ℃恒温摇床温育24 h。经90%、70%乙醇溶液梯度复水，然后在0.05%碳酸锂溶液和70%乙醇中反复浸泡，进行分化。最后乙醇、50%二甲苯和100%二甲苯梯度脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察髓鞘完整性。使用Image-Pro Plus 软件分析脱髓鞘面积和脊髓总面积，计算脱髓鞘面积占脊髓总面积的百分比。

1.2.8 免疫荧光染色 冰冻切片经PBS浸洗，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 封闭。加入抗nestin 抗体、抗NG2 抗体（用含1% BSA 和0.3% Triton X-100 的PBS 稀释），4 ℃孵育过夜。PBS 洗3 次，加入荧光素Alexa Fluor®594 标记的二抗和DAPI 染液（1 μg/mL），室温孵育1.5 h，PBS 洗3 次。以未加一抗的样品作为阴性对照。50%甘油水溶液封片，荧光显微镜采集数据，使用Image-Pro Plus 软件进行细胞计数。收集经慢病毒转染的MSCs 细胞球，使用抗CCR5 抗体和Alexa Fluor®594 标记的二抗进行免疫荧光染色。

1.2.9 Western blotting 小鼠新鲜脊髓组织经超声破碎，获取蛋白质溶液。蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转膜至聚偏二氟乙烯膜，封闭，抗BDNF 抗体、抗NT-3 抗体、抗NGF 抗体、抗GDNF 抗体、抗GAPDH抗体分别孵育；用含0.3% Triton X-100 的PBS 洗涤后，辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育，增强化学发光（ECL）显色。使用ImageLab 4.0软件分析各蛋白条带灰度值相对于内参GAPDH 的比值，计算各组蛋白含量相对于EAE模型组的比值。

1.3 统计学分析

使用Graphpad Prism 5 软件对数据进行处理，定量数据采用x±s表示。临床症状评分和体质量的比较采用双因素方差分析（two way ANOVA）；其他数据2 组间比较使用韦尔奇校正的非配对t 检验，3 组或以上的比较使用Tukey多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCR5-MSCs的鉴定

荧光显微镜下观察发现，转染慢病毒的MSCs细胞球同时表达GFP蛋白和CCR5蛋白，表明转染成功。流式细胞仪检测结果显示nestin+CCR5+细胞数达83.5%，表明CCR5-MSCs具有神经干细胞的特点（图1）。

2.2 Fasudil联合CCR5-MSCs对EAE临床症状的缓解作用

从免疫后第18 日开始，fasudil 干预组、CCR5-MSCs干预组、fasudil联合CCR5-MSCs 干预组EAE 临床症状评分较EAE 模型组明显降低（图2A）。Fasudil 联合CCR5-MSCs 干预比fasudil 或CCR5-MSCs 单独干预能够更加明显地减轻EAE临床症状，显示了fasudil与CCR5-MSCs的叠加效果。MOG35-55免疫导致小鼠体质量下降。免疫后第22～24日，fasudil干预组和fasudil联合CCR5-MSCs干预组小鼠体质量有所恢复，与EAE 模型组差异有统计学意义（图2B）。在其他时间点各组体质量差异均无统计学意义。

2.3 Fasudil联合CCR5-MSCs对髓鞘的保护作用

脊髓冰冻切片LFB染色结果显示，MOG35-55免疫导致明显的脱髓鞘现象，fasudil 干预、CCR5-MSCs 干预、fasudil 联合CCR5-MSCs 干预均能抑制髓鞘脱失，并且fasudil 联合CCR5-MSCs 干预比其他单独干预能够更明显地减轻脱髓鞘现象，显示了fasudil 与CCR5-MSCs 叠加的髓鞘保护效果（图3）。

图1 表达CCR5的慢病毒在MSCs中的转染效率Fig 1 Transfection efficiency of CCR5 lentivirus in MSCs

图2 Fasudil联合CCR5-MSCs对EAE临床症状的影响Fig 2 Effect of fasudil combined with CCR5-MSCs on the clinical symptoms of EAE

图3 Fasudil联合CCR5-MSCs对脱髓鞘的抑制作用Fig 3 Inhibitory effect of fasudil combined with CCR5-MSCs on demyelination

2.4 Fasudil 联合CCR5-MSCs 对神经干细胞和少突胶质前体细胞的动员

脊髓冰冻切片免疫荧光染色结果显示，在EAE 模型组、CCR5-MSCs 干预组中均没有nestin+细胞（神经干细胞） 和NG2+细胞（少突胶质前体细胞） 出现，但在fasudil 干预组、fasudil 联合CCR5-MSCs 干预组中出现大量的nestin+细胞和NG2+细胞，而且fasudil 联合CCR5-MSCs干预组中nestin+细胞和NG2+细胞数目比单独fasudil干预组明显增多（图4）。

2.5 Fasudil联合CCR5-MSCs对髓鞘再生的促进作用

Western blotting结果显示，EAE模型组中神经营养因子BDNF、GDNF、NGF 和NT-3的表达量均较低，fasudil干预组中NGF 和NT-3 的表达明显增加，CCR5-MSCs 干预组各神经营养因子的表达没有明显变化，fasudil 联合CCR5-MSCs 干预使得BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表达量明显升高（图5）。

3 讨论

EAE 是国际上公认的研究MS 的一种动物模型。经MOG35-55免疫后，小鼠脊髓组织可出现明显的脱髓鞘现象。骨髓中存在的MSCs具有自我更新、高度增殖和多系分化能力，同时具有取材方便、可进行自体移植、容易体 外 扩 增 的 优 点［5］。Karussis 等［6］使 用MSCs 治 疗 了15 例MS 和19 例肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），6～25个月的随访结果显示MSCs能够逃避宿主免疫应答，到达脑膜、蛛网膜下腔和脊髓组织，能明显降低临床症状评分，对MS和ALS显示出良好的治疗效果，且具有较高的安全性。MSCs可能通过免疫调节作用治疗EAE［7-9］。

虽然大量研究显示MSCs治疗EAE/MS 有效，但治疗效果仍不够理想。其原因可能包括：①经静脉注射的MSCs通过血液循环进入并分布于全身多个器官，最终进入CNS 所需的时间长、效率低。②EAE/MS 损伤过程中，CNS 出现炎症反应、氧化应激和大量的神经再生抑制因子，从而抑制了MSCs 的存活、增殖和功能发挥。因此，为提高MSCs 移植的疗效，需要综合考虑干细胞移行、CNS 微环境等诸多因素。Yang 等［3］将表达CCR5 的慢病毒转入神经干细胞，然后静脉给予EAE 小鼠，增强了神经干细胞向CNS 炎症部位迁徙的数量和速度，治疗效果明显优于单纯用神经干细胞的对照组；该研究认为过表达CCR5 的神经干细胞在EAE 发病早期进入CNS，通过其有效的免疫调节作用，减轻了CNS 的炎症反应，从而阻止了髓鞘和神经元的损伤，同时也有利于髓鞘再生。另外，也有研究［10］显示鼻腔给予成体神经干细胞可以降低EAE 的临床症状；细胞经嗅部黏膜吸收进入脑脊液，绕过血脑屏障直接进入CNS，也可以通过血液循环或淋巴系统、三叉神经、视神经等间接通路进入脑内，有效地发挥治疗作用。相较于尾静脉、腹腔和脑立体定位注射途径，细胞经鼻腔途径进入CNS 的速度更快，数量更多，治疗效果也更好［11］，因此被广泛应用于CNS 疾病治疗的研究［12-14］。

本研究通过鼻腔途径，将CCR5-MSCs于EAE发病初期给予小鼠，发现其能明显地降低EAE的临床症状评分，减少髓鞘的丢失；但是EAE 发病过程中，CNS 内的不良微环境可能限制MSCs发挥更好的治疗作用。小分子化合物干预在干细胞生物学研究中的应用已成为生命科学领域 的 热 点［12］。ROCK 抑 制 剂，如Y-27632、fasudil、pyrintegin 和thiazovivin，具有促进干细胞增殖、存活和抑制干细胞分化的作用［12，15］。课题组前期使用fasudil 联合神经干细胞治疗EAE 和帕金森病模型小鼠的实验中，发现给予fasudil能明显增加神经干细胞在CNS内的数量，提升神经干细胞抗炎、抗氧化能力，从而达到良好的治疗效果［4，16］。

本研究中，在给予CCR5-MSCs 之后给予fasudil，EAE 的临床症状评分更低，髓鞘丢失更少。单独给予CCR5-MSCs时内源性nestin+和NG2+干细胞未被动员，联合fasudil 干预之后nestin+和NG2+干细胞动员能力明显强于单独fasudil 干预组，说明fasudil 激发了CCR5-MSCs 的神经干细胞动员和少突胶质前体细胞动员的能力。另外，单独给予CCR5-MSCs 并没有促进神经营养因子BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表达，单独给予fasudil 也仅仅增加了NGF 和NT-3 的表达，但是两者联合却使得BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表达量极大地提升，再次说明fasudil能明显促进CCR5-MSCs的神经保护作用。

综上所述，fasudil联合鼻腔途径给予过表达CCR5 的MSCs，可发挥神经保护和促髓鞘再生的作用，明显提升EAE的治疗效果。