张韩，刘枫，李彦明，姚新亮，鲁雪丽

(河南大学淮河医院 a.心血管内科;b.重症医学科，河南 开封 475000)

急性心肌梗死是心血管疾病中发作极为危急的类型，通常因冠状动脉急性阻塞导致心肌缺血缺氧而发生坏死。目前，临床上通常采用再灌注治疗急性心肌梗死，但易发生心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤，影响疾病临床治疗及预后[1-2]。β-catenin是经典的信号传导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡等众多生命活动的调控[3]。微小RNA-27b(miR-27b)是miRNAs家族成员之一，与多种肿瘤、多种心脏疾病的发生发展密切相关[4-5]。Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein 3，BNIP3)是Bcl-2家族成员，在缺血再灌注过程中通过介导线粒体自噬影响心肌细胞损伤[6]，但是如何通过细胞通路影响这一过程不是十分清楚。本研究利用缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌细胞模型模拟体内心肌I/R损伤，探讨miR-27b靶向BNIP3对H/R心肌细胞β-catenin通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器大鼠H9c2心肌细胞(货号：YBCC337726)购自美国ScienCell；DMEM培养基(货号：KL-P0032)购自德国merck/sigma公司；Lipofectamine 2000转染试剂(货号：11668019)购自Invitrogen公司；CCK-8试剂、BNIP3抗体、轴抑制因子1(Axin1)抗体、β-连环蛋白(β-catenin)抗体、GAPDH抗体(货号：ab228554、ab219609、ab233652、ab32572、ab181602)购自美国abcam公司；荧光定量PCR试剂盒、无序siRNA、miR-27b siRNA均由生工生物工程有限公司合成。恒温培养箱(型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC)购自日本松下公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪(型号：MODEL550)购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 将H9c2细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中，2～3 d换液1次，待细胞密度达到80%左右时，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化、传代培养。

1.2.2H/R模型建立及分组 取对数生长期H9c2细胞以每瓶2×105个接种于培养瓶中，培养24 h，弃上清液，换DMEM无糖无血清培养基，置于抽气型厌氧罐(先将罐中空气抽净在注入体积分数为5% CO2、94% N2、1% O2混合气体)于37 ℃密闭培养箱中培养3 h，即缺氧处理。弃上清液，换含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基，置于正常氧浓度(体积分数为5% CO2、95%空气混合)的培养中培养3 h，即复氧处理。

实验设置正常对照组(H9c2细胞正常培养)、H/R组(H9c2细胞经H/R处理)、H/R+NC组(H9c2细胞转染无序siRNA后经H/R处理)和H/R+miR-27b siRNA组(H9c2细胞转染miR-27b siRNA后经H/R处理)。H/R+NC组和H/R+miR-27b siRNA组细胞转染均采用Lipofectamine 2000转染试剂进行。

1.2.3实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法检测各组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA表达情况 将H9c2细胞按照1.2.2分组处理后培养48 h，收集细胞，使用TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用qRT-PCR法检测miR-27b、BNIP3mRNA表达水平，内参基因为U6、β-actin。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 2 min，共循环40次；72 ℃ 10 min。miR-27b上游引物：5’-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，下游引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；BNIP3 mRNA上游引物：5’-GTCGCAGAGCGGGGAGGAGA-3’，下游引物：5’-TCTGGGAGCGAGGTGGGCTG-3’；内参U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；内参β-actin上游引物：5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’，下游引物：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3’。Ct值为扩增产物的荧光信号达到临界阈值时对应的循环数，miR-27b、BNIP3mRNA相对表达量以2-ΔΔCt法表示。

1.2.4蛋白印迹(western blot，WB)法检测各组H9c2细胞中BNIP3、β-catenin蛋白表达情况 将H9c2细胞按照1.2.2分组处理后培养48 h，收集细胞，使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。电泳分离等量蛋白质并转至PDVF膜上，用含50 g·L-1脱脂奶粉的TBST封闭1 h，分别加入BNIP3抗体、β-catenin抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度，目的蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值。

2 结果

2.1 各组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA表达情况H/R组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA表达水平均高于正常对照组(P<0.05)；H/R组与H/R+NC组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；H/R+miR-27b siRNA组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA表达水平低于H/R组和H/R+NC组(P<0.05)。见表1。

表1 各组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3 mRNA表达水平比较

2.2 各组H9c2细胞中BNIP3、β-catenin蛋白表达情况H/R组H9c2细胞中BNIP3、β-catenin蛋白表达水平高于正常对照组(P<0.05)，β-catenin蛋白表达水平低于正常对照组(P<0.05)；H/R组与H/R+NC组H9c2细胞中BNIP3、β-catenin蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；H/R+miR-27b siRNA组H9c2细胞中BNIP3蛋白表达水平低于H/R组和H/R+NC组(P<0.05)，β-catenin蛋白表达水平高于H/R组和H/R+NC组(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组H9c2细胞中BNIP3、β-catenin蛋白表达情况

表2 各组H9c2细胞中BNIP3、β-catenin蛋白表达水平比较

3 讨论

心脏是重要的功能器官，向器官、组织提供充足的血流量，通过推动血液流动运送氧和各种营养物质，带走代谢终产物，维持细胞正常的功能。目前，心血管疾病是威胁人类健康的重大疾病之一，平均每年死于心血管疾病的人数高达1 790万人，占死亡总数的31%[7]。临床上治疗急性心血管疾病通常采用再灌注，该治疗过程中引起的氧化应激和炎症损伤会导致缺血心肌组织进一步受损，影响心肌功能恢复[8]。I/R诱导的心肌损伤是一个复杂的、多因素的病理生理过程，伴随着心肌细胞的坏死、凋亡及自噬。而心肌细胞H/R可在一定程度上与心肌I/R损伤过程类似，常用来模拟心肌I/R损伤过程。

miR-27b是microRNA家族重要成员，在心脏疾病发生过程中起重要作用。刘刚等[9]研究表明，抑制miR-27b表达可降低病毒性心肌炎心肌细胞氧化应激反应及凋亡率。Liang等[10]研究表明，miR-27b与炎症反应、细胞凋亡过程有关。BNIP3属于Bcl-2家族蛋白，其BH3结构域能与抗凋亡蛋白形成异二聚体，抑制后者的抗凋亡作用，从而介导细胞死亡过程[11]。刘鼎乾等[12]研究表明，BNIP3在大鼠心肌缺血再灌注过程中介导线粒体自噬，清除损伤的线粒体，对防止活性氧大量释放、激活细胞死亡通路有重要作用。本研究结果显示，H/R组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA及蛋白表达水平均低于正常对照组，推测miR-27b、BNIP3参与H9c2细胞H/R损伤过程。

β-catenin通路是与细胞增殖、分化、凋亡有关的关键信号通路，主要通过调节β-catenin活化，进而控制通路下游基因表达来发挥作用，在肝脏缺血再灌注损伤中发挥改善氧化应激损伤、减轻炎症免疫应答、减少细胞凋亡、调节细胞自噬等作用[13]。邓荣荣等[14]研究表明，肾衰康灌肠液含药血清可能通过激活β-catenin通路抑制H/R损伤肾小管上皮细胞的凋亡/死亡过程。自噬在缺血-再灌注过程中的作用是一把“双刃剑”，早期可能通过减少能量消耗、清除受损细胞器来恢复细胞稳态，后期过度激活导致细胞器绝对数目减少，能量供给不足，加重细胞损伤[15]。本研究结果显示，与正常对照组相比，H/R组H9c2细胞中β-catenin蛋白表达水平显著降低，表明H9c2细胞H/R处理后β-catenin信号转导通路受到抑制。

本研究对 miR-27b在H9c2细胞经H/R处理后的作用进行分析，结果显示H/R+miR-27b siRNA组H9c2细胞中miR-27b、BNIP3mRNA表达水平、BNIP3蛋白表达水平低于H/R组、H/R+NC组，β-catenin蛋白表达水平高于H/R组、H/R+NC组，提示抑制H9c2细胞中miR-27b表达后，BNIP3转录、翻译水平随之降低，β-catenin信号转导通路被激活。BNIP3作为凋亡因子，与β-catenin通路共同在心肌细胞缺氧损伤中发挥作用，在心肌缺血灌注过程中介导线粒体自噬[12,16]。本研究中，miR-27b可能通过调控BNIP3途径影响H/R心肌细胞β-catenin通路的调控。

综上所述，miR-27b可通过调控BNIP3对H/R心肌细胞β-catenin通路产生一定影响，即沉默miR-27b表达后可抑制BNIP3转录、翻译水平，激活β-catenin信号转导通路进而影响细胞的自噬。但考虑到β-catenin信号转导通路及自噬作用的复杂性，还需进一步研究其与miR-27b、BNIP3间的具体作用关系，以期为临床治疗中减少心肌I/R损伤提供帮助。