程少波，宋 阳，杨巽喆，马 啸，周永红,3，张海琴,3

（1.四川农业大学小麦研究所, 四川 成都 611130；2.四川农业大学草业科技学院, 四川 成都 611130；3.西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室, 四川 成都 611130）

多花黑麦草（Lolium multiflorum)，又称一年生黑麦草、意大利黑麦草，是一种冷季型优良牧草，具有生长迅速、产草量高、适口性好、消化率高等特点，具有较高的经济价值，在欧洲、亚洲、非洲等世界各地种植[1]。截至2021 年，我国共审定登记一年生黑麦草品种19 个，其中，育成品种仅5 个[2]。一年生黑麦草是异花授粉植物，种内不同种质间会发生频繁的基因交流，导致某一品种不同种子之间的基因构成可能都不相同[3-4]。随着国家粮改饲及退耕还林还草政策的全面实施，我国各大牧区对优良一年生黑麦草种质的需求日益增长，但目前市场上销售的一年生黑麦草品种种子混杂，质量较差，品种的一致性也表现较弱，导致农牧民难以按照生产需求选择合适的品种。因此，对一年生黑麦草品种的正确鉴定显得尤为重要。

牧草品种鉴定主要有形态学、物理化学、生化和DNA 指纹图谱等不同方法[5]。目前形态学鉴定方法主要是DUS 测试鉴定法，主要包括特异性（distinctness)、一致性（uniformity)和稳定性（stability)测试[6]，但是DUS 鉴定法存在一定的弊端，测试周期长、耗费大量人力和物力且结果易受环境影响；DNA 分子标记鉴定法从DNA 分子角度鉴别不同品种，多态性高、操作简便、鉴定结果精准可靠。牧草品种大多来源于野生种驯化和优势品种杂交[7]，SSR 标记具有稳定性好、共显性及多态性高等特点，被广泛应用于牧草的指纹图谱构建。赵闫闫等[8]利用早熟禾基因组中开发出来的3 对多态性SSR引物对18 个早熟禾（Poa annua)品种进行指纹图谱构建；陈冬明等[9]利用引物EST-SSR750 构建了9个鸭茅（Dactylis glomerata)材料的指纹图谱；SSR标记在一年生黑麦草品种鉴定中得到了广泛应用[10-12]。罗永聪等[10]从来自一年生黑麦草基因组中的100 对SSR 引物中筛选出12 对引物。这12 对引物多态性高，其中引物LMgSSR15-08C 在多个品种中具有特征谱带，这12 对引物将21 份黑麦草分为三大类，可用作构建多花黑麦草品种指纹图谱。

‘川饲1 号’一年生黑麦草新品系由四川农业大学小麦族系统学与资源利用研究团队通过多亲本杂交及多次表型轮回选择法选育而成。母本群体为来自匈牙利的品种‘Billion’ （‘PI 611146’)，具有叶量丰富、叶片颜色深等特性，在四川成都平原上综合表现较好。父本群体有4 个：“杰威”多花黑麦草，植株直立，茎秆粗壮；来自新西兰的品种‘G.Manawa’ （‘PI 376875’)，越冬性强；来自瑞典的野生材料‘PI 283610’ （分蘖多)和‘PI 283612’ （种子大、千粒重高)。选育方法：5 份亲本群体相邻种植，去除感病、长势弱、开花特别早或特别晚的不良植株，剩余优良植株在自然条件下开放授粉，仅在‘Billion’优良植株（母本)上收获种子。基于产草量、花期及抗病性等性状进行连续多代轮回选择，最终获得性状稳定且综合表现较优的新品系328-4，命名为‘川饲1 号’。该品系于2021 年参加国家草品种区域试验。为建立‘川饲1 号’新品系的DNA 指纹图谱，本研究利用SSR 分子标记，对‘川饲1 号’及其亲本、18 份国审品种构建品种间 SSR 分子标记指纹图谱，并筛选新品系特异的SSR 指纹图谱，用于新品系的快速鉴定，并探讨品种间的亲缘关系，以期为新牧草品系的知识产权保护及品种资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料共23 份一年生黑麦草，包括‘川饲1 号’及其亲本，与18 份在全国牧草品种审定委员会登记的国审品种。PI 编号材料由美国国家植物种质资源库 （National Plant Germplasm System，Pullman，Washington，USA) 提供。材料来源信息如表1 所列。

表1 供试材料Table 1 The materials used in this study

1.2 DNA 提取

将种子置于双层滤纸上发芽，25 ℃恒温培养箱中培养，7 d 后选取新鲜的叶片采用改良CTAB 法[13]提取DNA。每个材料随机选取40 株单株叶片等量混合提取DNA。新品系‘川饲1 号’提取2 份DNA（各40 株叶片等量混合，命名为6-1 和6-2)。

1.3 引物合成

本研究选取罗永聪等[10]从100 对SSR 引物中筛选出的12 对高多态性引物构建一年生黑麦草新品种（系)指纹图谱。引物由生工生物工程（上海)有限公司合成，引物信息如表2 所列。

表2 12 对SSR 引物序列信息Table 2 Sequence information of 12 pairs of SSR primers

1.4 SSR-PCR 扩增及毛细管电泳检测

PCR 扩增反应总体积为20 μL，其中PCR-Mix （北京天根生化公司) 10 μL，正、反向引物各0.8 μL （10 pmol·μL-1)，模 板DNA 2 μL （10 ng· μL-1)，Taq DNA聚合酶0.4 μL （2.5 U·μL-1)，ddH2O 补足体积。PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；10 个降落PCR 循环：94 ℃变性30 s，退火温度由 65 ℃开始，每个循环降低 0.5 ℃，直至60 ℃，退火45 s，72 ℃延伸1 min；30 个循环：退火温度为60 ℃，变性和延伸温度同上；72 ℃延伸7 min，10 ℃保存。PCR 扩增所得产物用ddH2O调浓度至100 ng·μL-1，然后将样品上样至Agilent Fragment Analyzer 上进行毛细管电泳检测。

1.5 数据统计与聚类分析

用PROSize 3.0 软件对毛细管电泳得到的原始数据进行分析。仅统计每对引物目标片段 ± 50 bp范围内的片段（此范围外的片段为非特异产物)[14]。在相同扩增片段上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，在Excel 表格中将SSR 原始数据转化为0/1 矩阵。统计扩增产物的条带总数（total No.of bands, TNB)和多态性条带数量（No.of polymorphic bands, NPB)并计算多态性百分率（percentage of polymorphic bands,PPB)。用DataFormater 软件[15]将SSR 0/1 矩阵转化为Popgene 1.32 软件的格式，利用该软件统计每对引物在23 个一年生黑麦草材料当中的等位基因频率、香∑ 农 信 息 指 数（Shannon’s information index, I)，I=-Piln(Pi/n)，Pi为第i个等位变异的频率，n为检测到的位点总数及Nei’s 多样性指数（Nei’s gene diversity, H)。利用PIC-CALC 0.6 软件计算每个S co SnRt e位nt,点PI的C)多，P态IC性=信1-息∑量（p，l o其y m中o rpPhii为s m第i nfio个r m等a ti位on变异的频率。采用NTSYS-pc2.10e 软件计算Dice 遗传相似系数，按UPGMA （unweighted pair group method using arithmetic averages，非加权成对算术平均法)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR 标记多态性分析

12 对SSR 引物对23 份一年生黑麦草品种（系)进行PCR 扩增，共扩增出104 条多态性条带，12 对引物扩增的条带数变化范围为4～14 条，平均每对引物扩增出8.667 条带（表3、图1)。

多态性信息量（PIC)是衡量座位多态性高低程度的指标[16-18]。PIC 变化幅度为0.392～0.822，引物LMgSSR01-02G 的PIC 最低，为0.392，引物LMgSSR 02-12E 的PIC 最高，为0.822，平均多态性信息含量为0.613 （表3)。

香农指数（I)常用于评估种群遗传多样性，数值越大多样性越丰富[19-21]。12 对引物香农指数变化范围为0.911～2.061，平均为1.325。基因多样性指数（H)是一个种群中每个位点上平均期望杂合度，具有较高H 值的SSR 标记具有较高的检测效率[19]。12 对引物的H 变幅为0.407～0.838，平均基因多样性指数为0.650 （表3)。

表3 12 对SSR 引物的多态性及遗传多样性参数Table 3 The polymorphism and genetic diversity parameters of 12 SSR primers

2.2 聚类分析

UPGMA 聚类分析结果表明，23 份一年生黑麦草材料在相似系数0.725 处分为三大支，第一大支包括‘川饲1 号’及其亲本供体，其中‘川饲1 号’与品种‘Billion’ （母本)和‘杰威’聚为一小支，2 份野生材料‘PI 283610’、‘PI 283612’及‘G.Manawa’聚为另一小支；第二大支为12 个国审品种，其中‘川农1 号’、‘赣选1 号’、‘阿德纳’和‘长江2 号’聚为一个小支，另外‘赣饲3 号’等8 个品种聚为另外一小支；第三大支为‘邦德’、‘特高’和‘剑宝’等5 个品种（图2)。以上结果表明：‘川饲1 号’与亲本供体（特别是母本)亲缘关系较近，而与其他一年生黑麦草国审品种差异较大，亲缘关系较远。

图2 23 份一年生黑麦草品种(系)SSR 标记的UPGMA 聚类图Figure 2 UPGMA cluster based on SSR markers in 23 varieties of Lolium multiflorum

‘川饲1 号’的2 个重复（6-1，6-2)不同引物的所有扩增条带基本一致，遗传相似系数高达93%，表明‘川饲1 号’这一新品系遗传差异小，为稳定的遗传群体。该结果同时也表明本研究的PCR 反应体系比较稳定，重复性较好。

2.3 新品系指纹图谱构建

分析‘川饲1 号’新品系与其他品种的SSR 扩增条带，结果发现：引物LMgSSR02-12E 在‘PI 283 610’、‘G.Manawa’和新品系上的238 bp 处有特异条带，其他国定品种没有出现该条带（图1 箭头所示)。因此，以上引物可用来构建‘川饲1 号’的指纹图谱，用于新品系的快速鉴定。

图1 部分SSR 引物毛细管电泳图Figure 1 Capillary electrophoresis with partial SSR primers

3 讨论与结论

一年生黑麦草为优良牧草，在我国特别是南方地区广泛种植。品种种子的质量和纯度是种子管理的核心工作[22]。由于一年生黑麦草为异花授粉植物，因此市场流通中种子混杂、质量较低的现象较为普遍。DNA 指纹图谱的构建是以分子标记为基础，指纹图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性而且不易受环境影响，同时相比形态标记的DUS 测试具有快速、准确的特点，因此指纹图谱是鉴别品种、品系（含杂交亲本、自交系)的有力工具。指纹图谱主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SNP图谱等[23]。因SSR 标记具有多态性高、重复性好及共显性的特性，使其成为品种DNA 指纹分析较为理想的技术[24-27]。刘欢等[28]用30 对EST-SSR 引物中的25 对多态性引物构建了10 个一年生黑麦草品种的指纹图谱；蒙宇和王誉绯[29]用23 对引物对45份多年生黑麦草进行遗传多样性分析；Nie 等[30]利用SSR 标记对6 份四倍体多花黑麦草进行遗传变异性评价及品种鉴定。本研究选用罗永聪等[10]从100 对SSR 引物中筛选出的12 对高多态性引物，对18 份国审多花黑麦草品种进行分析并构建川饲1 号新品系的SSR 指纹图谱。12 对SSR 引物均表现出多态性，且Shannon 信息指数（I)及多态性信息含量（PIC)平均值分别为1.325 和0.613。罗永聪等[10]的研究中平均PIC 为0.843，其中引物LMgSSR15-08C的PIC 最高为0.934，而本研究该引物PIC 为0.637。有研究表明引物PIC 与群体遗传变异程度成正相关[31]，推测可能部分相同材料发生了遗传变异，导致某些特异标记的丢失或增加，同时本研究所用材料与罗永聪等[10]的研究材料只有12 份一致，剩余11 份材料包括其他国审多花黑麦草品种和新品系‘川饲1 号’及其亲本，从而导致本研究引物PIC 值与罗永聪研究不一致。当PIC ≥ 0.5，为高度多态位点，表明这些引物多态性较高，适宜用于一年生黑麦草品种SSR 指纹图谱的构建。

本研究的分子标记结果可以很好地反映多花黑麦草品种间遗传多样性及亲缘关系。部分具有亲缘关系的品种聚为一类，如‘川农1 号’和‘赣选1 号’聚为一小支，而‘赣选1 号’是‘川农1 号’的亲本之一；‘长江2 号’多花黑麦草是以‘阿伯德’和‘赣选1 号’为育种亲本材料，进行多次混合选育而成，在本研究中，‘赣选1 号’和‘长江2 号’聚为一个小支，而‘阿伯德’并未聚在同一支上，推测可能是由于‘阿伯德’多花黑麦草在育种过程中的多次混合选择作用，导致品种群体的特异位点基因频率发生改变。罗永聪[10]等研究中的‘特高’和‘杰威’聚类较近，而本研究中的‘特高’则与‘邦德’和‘达伯瑞’等聚为一支，聚类结果与Nie 等[30]的研究类似，由于大部分的国审多花黑麦草为引进品种很难获得系谱关系，加之材料异花授粉的特性，导致难以分析品种间的系谱关系，但本研究中系谱来源已知的材料聚类结果与系谱关系一致。因此，这些SSR 标记可以用于多花黑麦草品种的快速鉴定。

‘川饲1 号’是由5 个亲本（‘Billion’、‘杰威’、‘G.Manawa’、‘PI283610’和‘PI 283612’)经杂交及轮回选择选育而来，母本为‘Billion’。本研究利用SSR 分子标记鉴定了‘川饲1 号’的来源，聚类结果表明：新品系‘川饲1 号’与5 个亲本材料聚为一大支，而其他17 份国审品种聚为另外一支，表明‘川饲1 号’与5 个亲本材料亲缘关系较近，而与其他国审品种关系较远。分子结果与实际选育过程一致。利用优良品种杂交创造变异或从自然群体变异中进行优良单株选择是植物新品种选育的重要手段[32]。亲本间的遗传相似性越小，从杂交后代中获得优良单株的机率就越高，因此，利用DNA 分子标记技术充分了解亲本的遗传背景为杂交品种和优良单株选育提供了参考。

引物LMgSSR02-12E 在新品系上扩增出大小为238 bp 的特有条带，其他材料都没有该带（图1)。该引物可用来构建‘川饲1 号’的指纹图谱，用于材料的快速鉴定。