梁宝萍，王 勇，赵红星，李 艳，姜 俊，段 莹

(驻马店市蔬菜遗传育种工程技术研究中心，驻马店市农业科学院，河南 驻马店 463000)

茄子(SolanummelongenaL.)是重要的蔬菜作物，其生长周期短，经济效益良好，且营养价值丰富，具有清热解暑、散血通肠、延缓衰老、降脂降压、防治胃癌等保健功能，在全世界广泛栽培[1]。茄子具有显著的杂种优势，利用杂种优势提高茄子的产量和品质具有重要意义，但传统的育种手段时间长、效率低等缺点已不能满足新的育种目标。生物技术对农业的发展做出了重大的贡献，其中单倍体育种能缩短育种年限，提高育种效率，在植物的育种和基础研究中有着重要应用价值[2]。获得单倍体的方法较多，最常用的方法之一是茄子的花药培养。在茄子花药诱导愈伤组织的过程中，愈伤组织可以从花药顶端、花药侧面以及花药基部3个不同部位诱导[3]。茄子花药可经由胚状体诱导和愈伤组织诱导两种途径再生，但后者是获得再生植株的主要方式[4]。

愈伤分化不仅绿苗率低，而且容易玻璃化、发育畸形、生长缓慢,而且植物组织存在很强的物种依赖性和基因型特异性[5]。在茄子花药培养的相关研究中，关于采花药时期、预处理、诱导培养基、植物生长调节剂、染色的倍性等方面均有详细的叙述，但是愈伤分化成苗的研究报道较少。愈伤成苗不定芽分化成苗率低，可改善培养条件及激素的种类以提高成苗率。茄子花药培养效果不佳，愈伤组织诱导率不高，绿芽分化率低，体细胞干扰严重，单倍体出现的频率较低等问题，仍然有待克服。本研究对茄子花药外植体进行愈伤组织诱导和绿芽分化研究，建立茄子单倍体育种技术体系，筛选具备分化不定芽潜能基因型，选择分化培养基、转分化时间，提高绿苗率，缩短茄子新品种材料选育时间。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试茄子(SolanummelongenaL.)品种为西安绿茄、绿翠二号、黑仙子、豫艺2号，均由驻马店市农业科学院园艺所蔬菜课题组提供。2018年3月育苗，4月底定植于试验地塑料大棚。定期去掉植株上开放的花和果，使植株始终处于开花状态，其他同常规田间管理。

1.2 方 法

1.2.1材料采集及预处理

参照张玉苗[6]的方法，分别采集不同品种茄子花冠长与花蕾萼基部差值在2 mm以内的花蕾，将采集的花蕾低温(4 ℃)预处理3 d后备用。

1.2.2外植体愈伤及分化诱导培养

将低温(4 ℃)预处理3 d后的花蕾取出，在流水下冲洗10 min，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞消毒6 min，之后10 min之内用无菌水冲洗4次。用无菌滤纸吸干花蕾表面水分，剥出花药接种在诱导培养基上(MS+0.2 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1KT+2%蔗糖+6 g琼脂)，高温(36 ℃)暗培养6 d后，再25 ℃暗培养30 d，愈伤接到F1培养基(MS+0.05 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA+1%蔗糖+6 g琼脂，pH=5.8)和F2培养基上(MS+0.05 NAA+1 mg·L-1ZT+1%蔗糖+6 g琼脂，pH=5.8)分化，选择西安绿茄、绿翠二号、黑仙子、豫艺2号适合的诱导激素，每个品种接种80枚花药。在适宜的分化培养基上分别培养3、4、5、6周后统计愈伤组织率和分化率，每个品种接种48枚花药，选择最宜转分化时间。

接种后观察污染情况，及时清除污染。30 d后，每隔7 d调查一次愈伤组织数、分化数、绿苗数、畸形数。

愈伤组织率(%)=(产生的愈伤组织数/接入的花药数)×100%(去除污染的)；

分化率(%)=(产生绿色原基的愈伤组织数/接入愈伤组织数)×100%(去除污染的)；

绿苗率(%)=(绿苗数/接愈伤组织数)×100%；

畸形率(%)=(畸形芽/绿苗数)×100%(去除污染的)。

2 结果与分析

2.1 诱导培养基对不同花药出愈形态的影响

茄子花药在诱导培养基上，经过高温处理之后，整个花药逐渐膨大，之后花药壁随着培养时间变成褐色，15 d左右出现愈伤组织。由图1可见，愈伤组织有4种不同的状态：第一种为黄白色松散型(图1 A)；第二种为黄白色紧密型(图1 B)；第三种浅绿色松散型(图1 C)；第四种浅绿色紧密型(图1 D)。

2.2 诱导培养基对不同花药分化的影响

不同的茄子品种在诱导培养基上形成的愈伤类型有所差别(表1)，翠绿二号，黑仙子分化黄白色松散型愈伤，分化芽点早，形成极少不定芽，生长速度较慢，后期容易玻璃化；西安绿茄，豫艺2号主要分化黄白色紧密型愈伤，这种类型的愈伤分化不定芽较多，生长缓慢，分化芽点的时间稍晚，愈伤生长缓慢，豫艺2号和西安绿茄分别分化少量绿色松散型愈伤和绿色紧密型愈伤，生长慢，第一个芽点分化时间最晚。

表1 愈伤类型分布Table 1 Distribution of callus types

2.3 不同转分化培养时间对出愈率和分化率的影响

接种培养30 d后，在F1和F2两种分化培养基上分化(表2)，在F1上豫艺2号分化率最高，为235%，西安绿茄分化率次之，达106.66%；在F2上豫艺2号分化率高，达120%，西安绿茄次之为67%。结果表明，豫艺2号和西安绿茄更适合在F1培养基上分化，细胞分类素6-BA的效果要优于ZT。而绿翠二号和黑仙子的花药在F2上的分化率优于在F1上，但是畸形率100%，说明这2个品种分化也较适合激素6-BA。

表2 不同分化培养基对茄子花药培养的影响Table 2 Effects of different differentiation media on anther culture of eggplant

分化后培养一段时间，不定芽有不同程度的畸形致使后期绿苗生长缓慢，甚至死亡。豫艺2号在F1上畸形率高达74%，在F2上畸形率64%，但是总体上绿苗率高于F2分化培养基。西安绿茄在F1上的畸形率低于在F2上的。在F1和F2上黑仙子分化的芽全部畸形，翠绿二号不定芽在F1上全部分化成畸形(表3)。结果表明，不同品种的茄子花药分化时对不同种类的激素敏感度不同，形成的畸形率较高。

表3 不同转分化时间对分化率的影响Table 3 Effects of different transdifferentiation time on differentiation rate

在诱导培养基上诱导后，在F1分化培养基(MS+0.05 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA+1%蔗糖+6 g琼脂)上培养3周、4周、5周、6周。翠绿二号、西安绿茄、豫艺2号在培养第5周转分化时分化率最高，分别为20%、107%、78%，而黑仙子在第4周转分；翠绿二号在第4、5、6周转分化都有分化，在第3周时分化率为0，西安绿茄、豫艺2号在第3、4、5、6周转分化都能分化成芽，黑仙子在其他时间转分化，分化率为0。

3 讨论与结论

供试的4个茄子品种均能诱导出愈伤组织，愈伤组织也都能分化出不定芽，茄子花药愈伤组织的绿芽分化受基因型、愈伤组织类型、分化培养基中植物激素类型、转分化时间的影响，在芥菜[7]、甘蓝[8]等作物中也出现类似的现象。证明基因型对花药再生的影响极为复杂，涉及到基因表达、激素代谢等多个生理生化反应[9]。松散型愈伤和紧密型愈伤组织都能诱导出绿芽，但是产生的绿芽生理状态不同，紧密型愈伤的分化成苗率较高，这与王蒂[10]的研究结果一致。本研究中松散型和紧密型愈伤组织均能分化出绿苗，但是松散型愈伤分化的绿苗畸形率高，容易生长缓慢，玻璃化。产生的原因可能是生长环境和培养环境对愈伤组织的形成有一定的影响,愈伤组织诱导培养基中激素种类对愈伤组织分化有一定的影响[11]。不同茄子继代的时间不同，分化率有所不同，这可能是调控小孢子发育过程中关键基因启动信号通路时间不同。

外源激素具有传递遗传物质的脱分化、再分化等发育信号的作用，而外源激素的效果与外植体以及愈伤组织本身内源激素的种类有密切的关系[12]。鲍生有等[13]在茄子花药愈伤再生植株研究中用苏茄5号在NAA和6-BA的激素组合获得了良好的效果，本研究结果与之相一致。茄子不同品种对分化激素种类不同，姜悬云等[14]使用ZT和NAA激素组合进行不定芽分化，获得较高的不定芽诱导率。结果表明，6-BA和ZT两种激素都能对茄子花药诱导的愈伤组织继代产生不定芽，对某些基因型茄子愈伤和不定芽具有良好的诱导效果。一定浓度的6-BA和ZT为芽再生所必须，但高浓度的6-BA和ZT容易造成畸形芽，不同材料对6-BA和ZT的敏感性不同，这与不同材料的内源激素有关[14]。激素对不同基因型茄子花药培养的影响有待进一步研究，以筛选出畸形率低，分化率高的激素和浓度。