李汶，廖怡，赵晓蒙，高伯迪，张前军，钟娟芳，杜娟，谭跃球，卢光琇

1.中南大学基础医学院生殖与干细胞工程研究所，湖南 长沙 410078；2.湖南省中信湘雅司法鉴定所，湖南 长沙410078

1 案 例

1.1 简要案情

因法定父亲怀疑孩子（3 岁男孩）非亲生，要求进行亲子鉴定。经被鉴定人知情同意后，采集法定父亲、孩子、母亲、外公和外婆的指尖血，根据《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383—2014）采用Chelex-100 法提取DNA。

1.2 检验过程

1.2.1 39 个常染色体及X 染色体STR（X-STR）基因座基因分型

对所提取的样本DNA 采用PowerPlex®21 系统（美国Promega 公司）和AmpFℓSTRTMIdentifilerTMPlus PCR 扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）在9700 型PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）上共扩增20 个常染色体STR 基因座和Amelogenin基因座，对提取的样本DNA 采用Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC［基点认知技术（北京）有限公司］扩增另外19 个常染色体STR 基因座。扩增产物在3130xl基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）上进行毛细管电泳，采用GeneMapperTMID-X软件（美国Applied Biosystems 公司）进行基因分型。

使用Investigator Argus X-12 QS 试剂盒（德国Qiagen 公司）对孩子及母亲的DNA 进行X-STR 基因座分型检测。

1.2.2 线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高变区检测

使用表1 所列引物对孩子及母亲外周血样本DNA 进行mtDNA 高变区Ⅰ（hypervariable region Ⅰ，HVR-Ⅰ）、高变区Ⅱ（hypervariable region Ⅱ，HVR-Ⅱ）的扩增。扩增条件：95 ℃预变性40 s；94 ℃ 40 s，58 ℃40 s，72 ℃40 s，35 个循环。PCR 产物于3500xL基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）上进行Sanger 测序。根据《法医物证鉴定线粒体DNA 检验规范》（SF/Z JD0105008—2018），使用BLAST 在线软件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比较孩子及母亲的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列，并将孩子和母亲的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列分别与mtDNA 修正剑桥参考序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）进行比较。

表1 mtDNA 高变区扩增引物Tab.1 Amplification primers of mtDNA HVR-Ⅰand HVR-Ⅱ

1.2.3 2 号染色体STR 基因座的检测

采用Primer-BLAST 在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）对2号染色体上15个STR 基因座进行PCR 引物设计（表2），其中正向引物进行荧光标记。

表2 增加的2 号染色体STR 基因座的PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences of additional autosomal STR loci on chromosome 2

对法定父亲、孩子和母亲外周血DNA 进行PCR 扩增。……