闫建华，许晓玲，李荷莲，王高伟

黄河三门峡医院，河南三门峡472000

世界老年人口增长迅速，据世界卫生组织报道，到2050年，世界60岁以上的老年人口将占总人口的22%［1］。随着年龄增加或衰老进程加快，衰老相关性疾病的发病率迅速增长。衰老是指人体细胞及组织在结构和机能上所出现的退行性变化现象，是生物生命过程中的必然规律［2-3］。其主要表现为器官质量减轻，细胞萎缩，胞质色素沉着，功能代谢降低，适应能力减弱，抗病能力低下等，所带来的医疗负担也日益加重［4-5］。现阶段国内外科研工作者对抗衰老和具有抗衰老活性的天然产物的研究远远不够，仍需积极探索和开发［6］。衰老的研究已经成为当今的一个研究热点及难点［7］。黄酮类化合物是一类在多种天然植物中广泛存在的酚类化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗癌和调节血管渗透等药理作用［8-9］。有研究发现，中药黄酮类化合物通过清除过多的自由基，减缓氧化应激反应，保护衰老机体脑、肝、睾丸和皮肤等组织，与自由基学说密切相关［10-11］。铁皮石斛为兰科石斛属多年生附生草本植物［12］，其具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功能，有免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗菌等作用［13］。铁皮石斛研究多聚集于多糖及碱类化合物，对酚类中的黄酮化合物研究甚少。有研究显示，霍山石斛多糖可改善衰老模型大鼠小肠形态结构，并对消化酶活性和营养素吸收产生有益影响［14］。本研究选取铁皮石斛总黄酮为研究对象，基于黄酮类化合物药理作用，观察铁皮石斛总黄酮对D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影响，为临床防治衰老疾病提供实验支撑。

1 材料

1.1 动物昆明（KM）小鼠50只，SPF级，雄性，4～5周龄，体质量18～22 g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20190003，温度25℃，湿度45%～75%饲养室。

1.2 药物与试剂铁皮石斛总黄酮，宝鸡晨光生物科技有限公司，含量：50.07%（即每100 g药材含TFHM生药量50.07 g）；抗坏血酸（辉瑞制药有限公司，批号：20180513）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20180708A）；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E201801015A）；丙二醛（monochrome display adapter，MDA）试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20181013A）；过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20181022A）；ATP酶试剂盒及羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20181025AE20181014A）；脂褐素（lipofuscin，LF）试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20181102A）；Ⅰ型胶原蛋白试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20181110A）；Ⅲ型胶原蛋白试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号：E20181108A）。

1.3 仪器TGL-16型高速冷冻离心机（湖南湘仪）；PT-3502型酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）。

2 方法

2.1 模型复制及给药小鼠于实验室适应性饲养1周，随机挑选10只为空白组，其余小鼠选取状态良好的依次分为模型组，抗坏血酸（100 mg·kg-1）组，铁皮石斛总黄酮高、低剂量组（400 mg·kg-1、200 mg·kg-1），每组10只。空白组除外，其余小鼠颈背部注射5%的D-半乳糖（400 mg·kg-1），空白组颈背部注射同体积生理盐水，空白组及模型组给予同等体积生理盐水灌胃，每天注射及灌胃给药1次，连续6周。每两周称小鼠体质量并变换剂量。末次给药2 h后，小鼠腹主动脉取血检测相关指标［15-16］。

2.2 指标检测

2.2.1 血清指标10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清，用ELISA法检测血清SOD、T-AOC活性及MDA含量。

2.2.2 皮肤组织检测小鼠背部皮肤脱毛，取1.5 cm×1.5 cm背部皮肤，剪去皮下组织称质量，用0.9%NaCl溶液中漂洗，吸水纸拭干，剪碎，加入预冷的0.9%NaCl溶液（0.9%NaCl溶液的体积总量是皮肤质量的9倍）和适量蛋白裂解液，用组织匀浆机匀浆，ELISA法检测皮肤组织中CAT、SOD、ATP酶活性及LE、HYP、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白含量。

2.2.3 脏器指数将胸腺、脾脏、肝脏和肾脏组织于4℃生理盐水中清洗，滤纸吸干水分，称质量，计算器官指数。

器官指数＝器官质量／小鼠体质量

2.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）的形式表示，运用单因素方差对各组间对比，依照方差齐性进行LSD法及Games-Howell法选择，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对小鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA含量的影响与空白组比较，模型组小鼠血清中SOD、T-AOC活性显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，铁皮石斛总黄酮各剂量组及抗血酸组均可不同程度升高模型小鼠血清中SOD、T-AOC活性，降低MDA含量（P＜0.05；P＜0.01）。见表1。

3.2 对小鼠皮肤组织SOD、CAT、ATP活性及HYP含量的影响与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织中SOD、ATP活性显著降低，CAT活性显著升高，HYP含量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，铁皮石斛总黄酮各剂量组及抗血酸组均可显著升高模型小鼠皮肤组织中SOD、ATP活性，显著降低CAT活性，显著升高HYP含量（P＜0.05；P＜0.01）。见表2。

表1 对小鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA影响（±s）

表1 对小鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA影响（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别n剂量／mg·kg-1 SOD／U·mL-1 MDA（c／μmol·L-1）T-AOC／U·mL-1空白组10-272.59±35.61**6.42±0.88**28.42±3.18**模型组10-188.68±26.27△△25.54±3.52△△19.04±3.20△△抗血酸组10 100 260.47±36.81**17.35±3.15**23.87±3.63**铁皮石斛总黄酮高剂量组 10 400 253.76±35.84**18.07±3.09**22.98±3.18**铁皮石斛总黄酮低剂量组 10 200 230.7±33.26**18.46±3.33**21.59±3.32*

表2 对小鼠皮肤SOD、CAT、ATP活性及HYP含量影响（±s）

表2 对小鼠皮肤SOD、CAT、ATP活性及HYP含量影响（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别n剂量／mg·kg-1 SOD／U·mg-1 pro CAT／U·mg-1 pro ATP／nmol·mg-1 prot HYP／mg·g-1空白组10-54.74±7.12**152.00±9.04**23.01±1.63**0.26±0.04**模型组10-26.69±4.32△△280.99±23.16△△14.58±1.06△△0.17±0.03△△抗血酸组10 100 50.74±4.48**201.84±13.01**20.18±1.46**0.45±0.09**铁皮石斛总黄酮高剂量组 10 400 48.42±5.81**230.70±15.06**19.23±1.24**0.41±0.08**铁皮石斛总黄酮低剂量组 10 200 42.45±4.89**257.53±16.26*17.76±1.87**0.31±0.05**

3.3 对小鼠皮肤组织Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、LF含量的影响与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白含量显著降低，LF含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，铁皮石斛总黄酮各剂量组及抗血酸组均可显著升高模型小鼠皮肤组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白含量，降低LF含量（P＜0.05；P＜0.01）；铁皮石斛总黄酮低剂量组虽可升高模型小鼠皮肤组织中Ⅲ型胶原蛋白含量，但统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 对小鼠皮肤组织Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、LF含量影响（±s）

表3 对小鼠皮肤组织Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、LF含量影响（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别n剂量／mg·kg-1Ⅰ型胶原蛋白／ng·g-1Ⅲ型胶原蛋白／ng·g-1 LF／pg·L-1空白组10-554.38±32.01**108.09±10.31**2.62±0.19**模型组10-384.66±26.78△△68.73±8.14△△7.59±0.56△△抗血酸组10 100 504.38±34.54**98.53±6.11**3.00±0.28**铁皮石斛总黄酮高剂量组10 400 497.28±26.97**92.49±7.65**3.54±0.42**铁皮石斛总黄酮低剂量组10 200 417.38±34.58*75.10±5.29 4.13±0.53**

3.4 对小鼠胸腺、脾脏、肝脏、肾脏脏器指数的影响

与空白组比较，模型组小鼠胸腺、脾脏、肾脏脏器指数均呈现下降趋势，肝脏脏器指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，铁皮石斛总黄酮各剂量组及抗血酸组均可不同程度升高模型小鼠胸腺、脾脏、肾脏脏器指数，肝脏脏器指数降低（P＜0.05；P＜0.01）；铁皮石斛总黄酮低剂量虽可升高模型小鼠肾脏指数，但无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 对小鼠胸腺、脾脏、肝脏、肾脏脏器指数影响（±s）

表4 对小鼠胸腺、脾脏、肝脏、肾脏脏器指数影响（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别n剂量／mg·kg-1胸腺／mg·g-1脾脏／mg·g-1肝脏／mg·g-1肾脏／mg·g-1空白组10-2.51±0.28**3.06±0.28**39.18±4.58**21.01±1.82**模型组10-1.56±0.24△△1.98±0.28△△58.24±6.79△△15.21±0.49△△抗血酸组10 100 2.32±0.31**2.75±0.28**45.56±6.03**20.61±1.57**铁皮石斛总黄酮高剂量组 10 400 2.07±0.25**2.47±0.33**47.33±5.90**18.04±1.64**铁皮石斛总黄酮低剂量组 10 200 1.91±0.25**2.35±0.34*42.52±5.59**16.84±2.11

4 讨论

皮肤老化主要由内源性生理因素及外源性生理因素造成，现阶段对皮肤衰老的研究多通过建立相应动物模型，尤其是研究小鼠老化模型［17］。亚急性衰老模型和光老化模型是目前常见的老化模型。D-半乳糖所致皮肤衰老属于亚急性衰老模型，正常机体代谢中D-半乳糖可转变为葡萄糖，参与葡萄糖代谢过程［18］。当机体过量摄入后导致代谢紊乱，使各器官氧化酶活性改变，形成更多超氧阴离子及各种氧化产物等，引起细胞损害，以致机体多器官、多系统功能减退，最终导致衰老。此模型建模时间短，成模率高，模型稳定，部分指标与自然衰老类似，因此得到广泛应用［19-20］。

研究发现，黄酮类化合物通过清除过多的自由基，减缓氧化应激，保护衰老机体脑、肝、睾丸和皮肤等，如淫羊藿总黄酮、柿叶黄酮、苦参总黄酮、大豆黄酮、草豆蔻总黄酮、苦丁茶黄酮等［21-22］。针对皮肤衰老的防治主要涉及氧化应激、细胞凋亡、胶原修复、炎症反应及免疫抑制等。衰老患者机体内自由基增多，激活氧化应激反应，体内SOD含量降低，MDA含量升高，T-AOC能力降低［23-24］。CAT是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内，含量增加或减少可间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度［25］。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，在物质运送能量转换及信息传递方面具有重要作用，是体现机体抗氧化能力的重要活性酶之一。LF是溶酶体作用机体细胞后不能被消化的物质而形成的残余体，沉积于浅表皮肤者就是人们俗称的“老年斑”，其积累随年龄的增长而增多，是评价衰老的重要指征之一［26-27］。本研究发现铁皮石斛总黄酮可有效调节模型小鼠体内SOD、T-AOC、ATP活性，降低CAT活性及MDA含量，提示抗衰老机制与降低氧化应激反应有关。Hyp是胶原蛋白中最重要、含量最多、且最稳定的氨基酸，其作为间接反映胶原纤维总量的指标来衡量真皮衰老的程度［28］。胶原纤维是真皮的主要结构物质，占皮肤干质量的80%。人真皮中的胶原主要由Ⅰ型胶原（80%）和少量Ⅲ型胶原（10%）组成，皮肤质地主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的比例决定，两者比例失调将引起皮肤质量发生变化［29］。衰老患者皮肤中所含的胶原纤维会逐渐降解，从而损害了真皮结构的完整性。HYP活性降低，HYP合成减少，体内胶原蛋白合成也随之降低，因而HYP的含量可反映体内胶原的含量［30］。结果显示，铁皮石斛总黄酮可有效升高机体内HYP、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白含量，可知抗衰老机制可能与促进机体内胶原修复有关。

本研究可知铁皮石斛总黄酮对皮肤衰老小鼠具有一定干预作用，后期需进一步深入分子通路方面，明确铁皮石斛总黄酮具体抗病机制，为临床防治皮肤衰老提供实验依据［31］。