李秀宇 董 黎 孙宇涵 李健康 刘晓迪 谭红岩 Saleem Uddin 李 云

(1北京林木分子设计育种高精尖创新中心/国家林业与草原局刺槐工程技术研究中心/林木育种国家工程实验室/北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；2河北省平泉市国有黄土梁子林场，河北 平泉 067500)

多倍体植物普遍存在于自然界中，染色体多倍化是植物进化的重要因素之一[1]。多倍体育种技术已广泛应用于生产研究中，在作物[2-3]、园艺[4-5]及林木[6-7]中均取得较大进展。

刺槐(Robinia pseudoacaciaL．)，属豆科蝶形花亚科刺槐属，耐干旱、瘠薄、耐轻度盐碱、抗污染能力强，具有良好的生态和经济价值，是荒山造林和水土保持先锋树种，且具有观赏、材用、蜜源和饲用价值[8-10]。刺槐原产于北美洲，19 世纪末引入我国，经引种驯化后广泛分布于国内各地[11]。四倍体刺槐首次在韩国报道，其由秋水仙素诱导种子获得[12]。与二倍体刺槐相比，四倍体刺槐的叶片厚度、大小、产量、营养物质含量[13-14]，遗传适应性和抗逆性均优于二倍体[15-16]。但四倍体刺槐材料较为单一，基因型不够丰富，没有可选择的群体，不利于优良品种的选育，更难以满足在生态建设、饲料、生物质能源等方面的需求。因此，迫切需要增加四倍体刺槐种质资源数量，构建基因型丰富的四倍体刺槐群体，建立四倍体刺槐的种质资源库，为选育优良四倍体刺槐无性系，满足木本饲料产业，促进生物质能源发展，缓解木材短缺问题，加强林业生态建设等方面提供技术支撑。

目前，对刺槐的无性繁殖、有性生殖、遗传多样性及抗逆性的研究较多[17-21]。对四倍体刺槐的研究多集中在抗逆性方面。本研究前期建立了离体条件下高效诱导四倍体刺槐的体系，在此基础上诱导出一批新型四倍体刺槐单株，通过离体培养技术获得了不同基因型的四倍体刺槐无性系[22]。在组培繁殖过程中，本研究前期发现不同无性系之间的生长差异非常明显。为了明确这些差异来源，并利用这些差异进行苗期早期预测，建立评价刺槐无性系的有效指标体系，本试验在前期研究的基础上，对二倍体和四倍体刺槐组培苗进行了形态和生理指标的测定，筛选育种对应的指标，并分析上述指标的相关性及差异性，旨在通过对比不同倍性刺槐、不同无性系刺槐之间的生长差异，为筛选四倍体刺槐优良无性系提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和培养条件

供试材料为播种获得的二倍体刺槐(2n ＝2X ＝22)，利用秋水仙素诱导种子获得的四倍体刺槐(2n ＝4X＝44)。这些种子来自4 个半同胞家系，共获得了23 个无性系。其中，二倍体无性系4 个，分别为H、J16-32、M26-52、A4；四倍体无性系19 个，分别为16、38、104、108、124、219、243、464、465、503、513、525、528、545、547、D18-2、D18-8、D18-14、M16-30。

培养基的物质配比为：MS+0．2 mg.L-1吲哚丁酸(3-indolebutyric acid， IBA)+30 g.L-1蔗糖+6 g.L-1琼脂(pH 值5．8)；光照条件为3 410 Lux，每天光照16 h，组培室温度为25±2℃。

1.2 试验方法

1．2．1 刺槐二倍体和四倍体形态指标的测定 每个系号随机选取长势良好苗龄35 d 的同一批次继代组培苗9 株，用直尺量取植株最顶端到其根系基部的长度，记为株高。目测植株的丛枝数并记录。将植株取出，小心去除培养基，用直尺测量主根长度，并统计侧根数量。每个系号随机选取长势稳定的9 片叶片，叠在一起用游标卡尺测量叶片厚度，重复3 次，取平均值，并计算相应的单个叶片厚度。再随机选取9 片叶片，用ESPERSSION 1680 台式扫描仪(日本爱普森)进行扫描，将扫描的图片存入电脑备用。

于上午9：00，从每个无性系中随机选取长势良好苗龄35 d 的同一批次继代组培苗，再从中随机选取3片长势稳定的叶片，在叶片背面均匀涂抹一层无色透明的指甲油，叶背朝上置于载玻片上，用镊子轻轻撕下背面的指甲油膜，滴一滴蒸馏水使撕下的表皮均匀展开，然后用吸水纸吸干水分，使用Olympus BX51 显微镜(日本奥林巴斯)观察测量，每个叶片随机选取一个视野进行观察(避开叶脉)，每个视野随机选取3 个气孔，记录其长、宽。

1．2．2 刺槐二倍体和四倍体生理指标的测定 采用南京建成生物公司的蛋白定量BCA 法测试试剂盒、脯氨酸测试试剂盒、植物丙二醛测试试剂盒测量刺槐可溶性蛋白(soluble protein， SPro)、脯氨酸(proline Pro)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。使用苏州科铭生物公司的试剂盒(微板法)测定叶绿素总量、叶绿素a、叶绿素b 含量。试验材料选长势良好苗龄35 d 的同一批次继代的组培苗，取叶片准确称量，置于离心管备用，每个无性系重复3 次，试验操作过程参考相关试剂盒说明书。

1．2．3 数据处理 采用Microsoft Office Excel 2007 对观测统计的数据进行整理和分析，用SPSS 24．0 进行方差分析(邓肯法)和相关性分析，并对二倍体和四倍体各性状差异进行t 检验。使用图像分析软件Lamina分析叶片长度、宽度、周长、面积、圆度、叶形指数相关指标。

2 结果与分析

2.1 方差分析及t 检验结果

对整理后的原始数据进行方差分析和t 检验，方差分析结果表明，各性状组间相应的概率值均为0．000，小于极显著水平0．01，表明所测量的各性状组内之间差异极显著，有筛选的意义。各测定性状t 检验的P值均为0．000，小于极显著水平0．01，表明各性状组间存在极显著差异，可以进行后续分析。

2.2 各无性系形态指标的比较

根据各无性系形态指标均值可以看出(表1)，不同无性系之间差异较大。同一倍性间各无性系差异明显，尤其是四倍体，在13 个形态指标中，最大值和最小值均来自四倍体的指标占8 个。

株高的最大值和最小值均来自四倍体，且最大值约是最小值的2．93 倍。丛枝数的最大值来自二倍体，最小值来自四倍体，分倍性比较可以看出二倍体的丛枝数较多，分生能力较强。主根最长的是无性系464，侧根数最多气孔的是无性系38，叶片最厚的是无性系528，气孔长和气孔宽最大的均为无性系38，叶片面积最大的为无性系465，叶片最圆的是无性系464，上述6 个无性系均是四倍体。叶形指数越小表示植株生长越健壮，叶形指数最小的是四倍体无性系D18-14，最大是二倍体无性系J16-32。总体来说，四倍体在上述形态指标的比较中优于二倍体，可根据育种目标开展定向选育。

2.3 各无性系生理指标的比较

根据对各无性系生理指标均值的分析(表2)，发现四倍体不同无性系之间仍存在较大差异。6 个生理指标中除丙二醛的最大值为二倍体天性系外，其余指标的最大值和最小值均来自四倍体。

SPro 含量的最大值是无性系D18-14，Pro 含量的最大值是无性系D18-2，MDA 含量的最小值是无性系243，这3 个无性系均是四倍体，相关生理指标的数据表明上述无性系具有较强的抗逆性。叶绿素a 含量的最大值是无性系464，叶绿素b 含量和叶绿素总量的最大值是无性系108，且无性系108 叶绿素a 含量仅次

于无性系464，综合考虑这3 个指标，无性系108 叶绿素含量丰富，具有较强的光合能力。由于叶绿素a 含量较高的无性系464 和108 是四倍体，说明四倍体具有较强的光合能力。

表1 各无性系形态指标均值Table 1 The mean of morphological indexes of each clone

表2 各无性系生理指标均值Table 2 The mean of physiological indexes of each clone

2.4 二倍体与四倍体刺槐形态指标的比较

由23 个无性系的13 个形态指标的变异分析可知(表3)，对于二倍体和四倍体无性系而言，均是叶片厚度的变异系数最大，叶片圆度的变异系数最小。二倍体叶片厚度的变异幅度为0．07～1．00 mm；四倍体叶片厚度的变异幅度为0．07～1．33 mm，表明四倍体叶片的变化幅度较大且叶片较厚。二倍体叶片圆度的变异系数为4．39%，变异范围为80．66%～88．19%；四倍体叶片圆度的变异系数为3．20%，变异范围为84．25%～92．78%。根据测定结果，可以初步认为所测定指标中的叶片厚度变异较为丰富，叶片圆度较为稳定。而且，只有二倍体的气孔长、叶片长、叶片圆度和四倍体的叶片圆度的变异系数小于10%，其余指标的变异系数均大于10%，说明所测定指标的变异较为丰富，不同倍性刺槐的不同无性系以及不同指标之间存在较为丰富的变异，这都有利于育种工作者根据不同性状及需求进行选择育种。

表3 二倍体与四倍体刺槐形态指标的变异分析Table 3 Variation analysis of morphological indices of diploid and tetraploid Robinia pseudoacacia L.

2.5 二倍体与四倍体刺槐生理指标的比较

根据对23 个无性系的6 个生理指标的变异分析可知(表4)，二倍体中SPro 含量的最小值和均值都大于四倍体，但其最大值比四倍体的小，说明对于单个无性系来说，四倍体刺槐的表现较好，而四倍体无性系之间差异较大。二倍体Pro 含量的最大值比四倍体的小，但其最小值和均值都大于四倍体的。对于MDA 含量，二倍体中最大值、最小值和均值都大于四倍体。二倍体中叶绿素a 含量的最大值、最小值、均值均小于四倍体。叶绿素b 和叶绿素总量则是二倍体的最小值大于四倍体，四倍体最大值和均值较二倍体大。

表4 二倍体与四倍体刺槐的生理指标Table 4 Physiological index of diploid and tetraploid Robinia pseudoacacia L.

2.6 二倍体与四倍体刺槐测定指标的相关性分析

通过对二倍体与四倍体刺槐的形态指标及生理指标进行相关性分析(表5)，发现气孔长与气孔宽呈极显著正相关，叶片长与叶片面积、叶片长与叶片周长、叶片宽与叶片面积、叶片宽与叶片周长均呈极显著正相关。叶形指数与叶片圆度呈极显著负相关；叶绿素a 与叶绿素b、叶绿素a 与叶绿素总量、叶绿素b 和叶绿素总量均呈极显著正相关。主根长与侧根数呈显著相关，侧根数与SPro 含量呈显著相关，叶片宽与叶绿素a 含量和叶绿素总量均呈显著相关。由相关性分析可知，各指标之间存在较为复杂的相关关系，因此，在选育过程中，不能只考虑某一指标，还需要综合考虑与其相关性极显著的其他指标。

3 讨论

对种质资源的形态和生理等指标的遗传多样性进行评价，有利于针对不同无性系的特点进行定向筛选，为后续的育种工作奠定理论基础[23-24]。

本研究对所选的23 个不同倍性刺槐组培苗无性系的形态指标及生理指标进行了分析，从形态指标的统计分析来看，不同倍性、不同无性系之间的不同指标均存在一定差异。除丛枝数和叶形指数两个形态指标外，二倍体其余形态指标的最大值均小于四倍体。而四倍体中，只有主根长和叶片圆度的最小值大于二倍体。与二倍体丛枝数的均值相比，四倍体的较小，但是，二倍体的圆度均值小于四倍体。而且，四倍体的叶片面积和周长的均值都大于二倍体。根据试验观测，四倍体的株型较二倍体更通直，且叶片较大较圆。这些表型分析对刺槐组培苗倍性的初筛提供了一定依据。二倍体叶形指数的最大值、最小值和均值都大于四倍体，而叶形指数较小是生长健壮的标志[25]。四倍体的株高、主根长均值也大于二倍体，由此可以初步断定四倍体的长势优于二倍体。四倍体的气孔长和宽均大于二倍体。气孔是植物与外界进行气体交换的通道，气孔导度会影响植物的蒸腾作用和光合作用，进而对植株的抗逆性及生态适应性造成影响，这也是四倍体较二倍体抗性较强的原因之一[26]。

SPro 是重要的渗透调节物质和营养物质，作为一种亲水胶体，SPro 可以提高细胞的持水能力，维持细胞膨压，抵御逆境伤害，对细胞的生命物质及细胞膜起到保护作用[27]。本研究发现，四倍体SPro含量的最大值比二倍体大，说明SPro 含量最高的无性系来自四倍体，可根据育种目标从四倍体中筛选出抗逆性强的无性系。

表5 二倍体与四倍体刺槐的形态指标及生理指标的相关性分析Table 5 Correlation analysis of morphological and physiological indexes between diploid and tetraploid Robinia pseudoacacia L.

Pro 是植物蛋白质的组分之一，植物在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷)体内Pro 含量显著增加。抗逆性强的品种往往积累较多的Pro，因此Pro 含量可以作为衡量植物抗性的生理指标[28]。本试验中，四倍体刺槐Pro 含量的变化范围较大，最大值也来源于四倍体，说明四倍体刺槐无性系之间差异较大，且抗逆性强于二倍体。此外，还可以根据不同无性系Pro 含量为抗性育种提供筛选依据。

MDA 是膜脂过氧化的主要产物之一，它能加剧膜的损伤，因此通常将MDA 含量作为衡量膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应强弱的指标，MDA 含量越高，表明细胞过氧化程度越严重[29]，植物细胞受到损伤的程度也越严重。本试验表明，四倍体MDA 含量维持在较低水平，其最大值、最小值以及均值都小于二倍体，说明测定的四倍体无性系的抗逆性整体优于二倍体。MDA 含量越少说明植物膜伤害程度越轻，光合产物降解越少。试验结果基本符合叶绿素含量越多，MDA 含量越少的规律。

光合作用是植物体内重要的代谢过程，是干物质积累的基础，关系到植物的产量和品质[30]。叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要场所，在一定程度上，叶绿素含量可以反映光合作用的强度及生物量[31]。本试验中，四倍体中叶绿素b 含量的最小值小于二倍体，但其余指标均大于二倍体，说明四倍体刺槐的叶片具有更强的光合能力。这与蔡力[32]和宋庆安[33]研究结论一致。

二倍体与四倍体刺槐在形态和生理指标中存在差异，这可能是多倍体重复基因剂量效应造成的，基因剂量增加时，生化活动也随之加强；也有可能是不同基因型引起的，供试的二倍体与四倍体刺槐遗传背景差异较大，23 个无性系来自4 个刺槐半同胞家系，不同无性系之间的差异由父本和母本以及染色体倍性共同作用引起。根据二倍体与四倍体刺槐各指标的最值，可以筛选出具备单一优良性状的最佳无性系以及具备多个优良性状的无性系。但是，不同倍性供试的无性系数量不同，对于二倍体与四倍体之间的评价，应综合考虑均值、最大值、最小值、标准误以及标准差之间的差异。

本研究比较了二倍体与四倍体刺槐组培苗形态和生理性状，反映了不同倍性及不同基因型组培苗之间的差异，但是，移栽后生长及各性状变化还需进一步探究。

4 结论

本研究以二倍体和四倍体刺槐的组培苗为材料，通过形态及生理多性状的比较分析发现，多数四倍体刺槐无性系在形态和生理指标方面都优于二倍体。可以根据本研究各无性系的不同性状表现，结合育种目标，筛选出优良四倍体刺槐无性系，丰富四倍体刺槐种质资源，为选择育种工作提供理论依据，也为后续试验奠定基础。