王维华，郭永刚，李敏

(1.青岛农业大学农学院，山东青岛266109；2.青岛农业大学园艺学院；3.淄博市周村区农业农村服务中心，山东淄博 255300)

植物根结线虫(Meloidogynespp.)是植物根系定居性内寄生生物，分布广泛，且寄主繁多，随着我国大量高毒杀线虫剂的禁用及根结线虫对传统杀线虫剂抗药性的累积，根结线虫病害的防治形势严峻[1]。西瓜是我国重要的经济作物，设施西瓜连作加剧了根结线虫病的发生。

研究发现轮作辣椒能有效降低西瓜根内根结线虫繁殖体数量，减轻西瓜根结线虫病的危害程度[2]，而不同的辣椒品种对根结线虫的抗性不同[3]。用抗根结线虫辣椒与黄瓜和葫芦轮作极大降低土壤中根结线虫二龄幼虫和卵的密度，减轻黄瓜根结线虫病的危害[4]。植物根系分泌物中的挥发性物质作为信号分子在根结线虫侵染识别过程中发挥着主导作用[5]。

为探究抗线虫辣椒品种在西瓜轮作过程中对西瓜根结线虫病害的效应，本试验选取了对根结线虫抗性不同的2个辣椒品种，利用根系分泌物自动收集装置收集根系分泌物，并用GC-MS进行成分分析。用辣椒根系分泌物分别处理南方根结线虫卵粒及二龄幼虫，结合两品种根系分泌物成分比对，初步探究抗病辣椒根系分泌物中的特异化感物质对根结线虫的抑制作用，为进一步探讨辣椒轮作防控西瓜根结线虫病害的机制及根结线虫病害的综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 辣椒根系分泌物的成分分析

1.1.1 根系分泌物自动收集

试验于2016年7～8月在青岛农业大学日光温室进行。辣椒品种为中抗线虫品种‘青农簇生椒’(青岛农业大学)和感病品种‘农家小尖椒’(哈尔滨金龙农业有限公司)。2016年7月1日辣椒种子催芽，7月5日播种，8月15日，将苗用去离子水冲洗干净，移栽到根系分泌物自动收集装置中[6]。收集分泌物的色谱柱中装有XAD-4大孔吸附树脂(SIGMA-ALDRICH.CO.)，树脂柱规格为15 mm×300 mm，采用湿法装柱。开启装置，控制离子水流量为1 L·h-1，连续收集10 d。将收集10 d的色谱柱取下，先用500 mL去离子水清洗，再用200 mL正己烷洗脱。将洗脱液在旋转蒸发仪上40 ℃下减压旋蒸至正己烷挥发完全，用10 mL甲醇溶解干物质，获得2种根系分泌物，于4 ℃下保存。

1.1.2 辣椒根系分泌物成分

采用GC-MS进行分析，参考陈潇[6 ]的方法。气相色谱仪为Agilent 6980N；质量选择检测器为Agilent Technologies 5973；分析软件为Agilent Chemstation，通过Agilent Chemstation化学工作站检索Nist标准质谱图库确定化合物。

1.2 辣椒分泌物对西瓜根线虫的影响

2016年9～11月在日光温室内进行。共设3个处理，6次重复。将‘京欣4号’西瓜种子催芽后，播种于装有灭菌基质(草炭∶蛭石体积比=2∶1)的15 cm×20 cm花盆中，每盆留1株壮苗。三叶一心时，接种3×105个·L-1根结线虫卵悬浮液10 mL，同时分别浇灌1 mL·L-1不同品种辣椒根系分泌物提取液10 mL·株-1，以等量灭菌的蒸馏水为对照。50 d后测定根围和根内根结线虫数量。

1.2.1 西瓜根围根结线虫和卵粒数的计数方法

采用离心漂浮分离法和乳酚油-酸性品红溶液染色法[7]，分别测定西瓜根内二龄幼虫、雌成虫数和根围土壤二龄幼虫、卵粒数等。将根系切成0.5～1.5 cm小段，混匀后随机取1 g鲜质量根采用酸性品红液染色法，于显微镜下观察计数根内线虫数量，表示方法为条·g-1。取100 g根围土壤于烧杯内，注水至600 mL；搅拌20 s静止1 min后，将上清液经500 μm网筛倒入38 μm网筛内，收集38 μm网筛内的土壤和线虫混合物，并在3 000 r·min-1离心5 min， 弃上清液并加入38.5%蔗糖溶液，充分混匀后3 000 r·min-1离心30 s，将上清液倾入26 μm网筛中，收集网筛中线虫和卵粒，定容并于体视显微镜下计数。

1.2.2 南方根结线虫孵化率测定

按照吕星光[8]的方法测定。取已灭菌的直径9 cm的培养皿，挑取并加入约100粒经1% H2O2表面消毒过的根结线虫卵粒，分别加入两种辣椒分泌物提取液10 mL，以灭菌的去离子水为对照。每处理重复3次。25 ℃黑暗培养。第2天开始观察线虫孵化情况，并每隔24 h观察一次，观察至第10天为止，计算线虫卵孵化率。

1.3 邻苯二甲酸二丁酯对南方根结线虫的影响

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为分析纯，南方根结线虫卵粒及二龄幼虫由青岛农业大学菌根研究所提供。

线虫孵化率和死亡率测定 取已灭菌的直径9 cm的培养皿，挑取并加入约100粒经1 % H2O2表面消毒过的根结线虫卵粒，分别加入浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mL·L-1的DBP水溶液，以灭菌蒸馏水为对照。计算线虫卵孵化率。25 ℃黑暗培养，24 h后观察二龄幼虫成活情况，并计算线虫死亡率及校正死亡率。杀线虫强弱分级标准按Chandravadana等[9]的方法进行。

1.4 数据统计及处理

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计，用DPS 7.05软件进行方差显著性分析(LSD法)。

2 结果与分析

2.1 辣椒根系分泌物对线虫孵化率的影响

如图1所示，各处理的线虫孵化率均随时间而呈“S”型曲线增长，除了在2 d和4 d对照(CK)与‘农家小辣椒’根分泌物处理的差异不显著外，其余均显著高于两种辣椒分泌物处理。在处理1～6 d，两种辣椒根系分泌物的线虫孵化率间无显著性差异，各处理孵化率增幅均在4～6 d达到最高，其中对照孵化率增幅最高，为16.67%。处理6 d至10 d，各处理的线虫孵化率增幅均逐渐减小。在处理后10 d，对照的线虫孵化率最高，为84.33%；‘青农簇生椒’根系分泌物处理的线虫孵化率最低，为60.67 %；‘农家小尖椒’分泌物处理的线虫孵化率为70.33 %。在7～10 d，两种辣椒分泌物处理的线虫孵化率均存在显著性差异。可见，两辣椒品种根系分泌物均能显著抑制根结线虫孵化，而且抗线虫品种 ‘青农簇生椒’根系分泌物对线虫孵化的抑制作用高于‘农家小尖椒’。

2.2 辣椒根系分泌物对西瓜根系根结线虫数量的影响

由表1可知，‘青农簇生椒’辣椒分泌物处理的西瓜根内及根围根结线虫数量均显著低于对照；‘农家小尖椒’分泌物处理的西瓜根围根结线虫幼虫和卵粒数量均显著高于‘青农簇生椒’， 且与对照差异显著。‘农家小尖椒’处理的西瓜根内根结线虫二龄幼虫和雌成虫数量均次于对照，且高于‘青农簇生椒’处理；‘农家小尖椒’根内二龄幼虫与对照差异不显著，而根内雌成虫数量显著高于对照且与‘青农簇生椒’间不存在显著性差异。

表1 辣椒根系分泌物对西瓜根内和根围根结线虫数量的影响Table 1 Effect of root exudates on the number of root knot nematodes in watermelon roots and rhizosphere 单位：(个·g-1)

2.3 两品种辣椒根系分泌物成分对比

在辣椒品种‘青农簇生椒’和‘农家小尖椒’根系分泌物中，分别检测到了17种和18种化学物质，包括酯类、烃类、酚类和胺类等(表2)。对比两个品种辣椒根系分泌物发现，‘青农簇生椒’中出现了‘农家小尖椒’没有的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。

表2 辣椒根系分泌物中化感物质Table 2 Allelopathic substance in root exudates of pepper

2.4 不同浓度DBP对线虫孵化率的影响

如图2所示，各处理的线虫孵化率均随时间而呈“S”型曲线增长，对照组孵化率均高于其他处理。在处理第3天，除对照组外，各处理间没有显著性差异，仅4 mL·L-1DBP与对照间差异显著；各处理孵化率增幅均在第4～6天达到最高，其中对照孵化率增幅最高，为16.67%，DBP浓度由低至高其线虫孵化率最高增幅为13.00%、10.33%、9.67%和9.33%。从第6天至第9天，各处理的线虫孵化率增幅均逐渐减小。在处理后第10天，对照的线虫孵化率最高，为84.33%；3 mL·L-1和4 mL·L-1DBP的线虫孵化率最低，分别为57.33%和55.33%，两个处理间无显著性差异。综上所述，线虫孵化率随DBP浓度的升高而降低。

2.5 不同浓度DBP对二龄幼虫死亡率的影响

由表3可见，DBP对南方根结线虫二龄幼虫具有显著的杀灭作用，且其死亡率及校正死亡率与DBP的浓度呈正相关。对照的死亡率为45.00%，与对照相比，4 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率最高，分别为94.44%、90.85%，活性强度为强活性；其次为3 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率分别为79.30%、63.63%，活性强度为较强活性；4 mL·L-1与3 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率不存在显著性差异。1 mL·L-1与2 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率分别为53.22%、16.68%和58.41 %、26.01 %，且与对照间无显著性差异，活性强度均为弱活性。

表3 不同浓度DBP对二龄线虫死亡率的影响Table 3 Effect of different concentrations of DBP on the mortalities of nematode J2

3 结论与讨论

植物根系分泌物与线虫的生长和繁殖密切相关[7]。植物根系能够向根际释放大量的化感物质，这些物质可以对土壤生物产生直接或间接的影响，当然也包括线虫[10]。根系分泌物中的化学物质可以吸引线虫向根部移动或反向排斥，或抑制线虫的运动能力，甚至使线虫死亡。感病材料根系分泌物能够促进胞囊线虫卵粒的孵化，而抗病材料根系分泌物则对线虫卵孵化具有明显的抑制作用[11-12]。抗性番茄砧木根系分泌物可直接或间接抑制南方根结线虫卵孵化与发育，从而抑制线虫在寄主根内的发育繁殖和再侵染；与感病番茄相比，抗性番茄根系分泌物的抑制效果更为明显，且随抗性増强抑制效果增加[13]。将不同抗性的茄子砧木接种南方根结线虫后，感病品种根系分泌物能够明显刺激线虫卵的孵化，而抗病品种在线虫侵染初期表现出显著抑制作用[14]，这可能是由于两种植物根系化感物质成分的差异造成的。从高抗、中抗和感病番茄材料的根系分泌物中均得到了DBP，且在未接种南方根结线虫前3种番茄根系分泌物中的DBP含量相近，而接种后根系分泌物中DBP含量随番茄材料抗线虫能力的增强而升高。感病番茄根系分泌物对南方根结线虫二龄幼虫具有吸引作用，而抗病番茄根系分泌物对南方根结线虫二龄幼虫具有排斥作用，且随抗性増强而增加[15]。

耿广东等[16]采用GC-MS分析法发现辣椒根系分泌物含有多种化感物质，其中DBP的含量最高。本试验通过对根结线虫抗性不同的两个辣椒品种的根系分泌物组成成分进行比对和分析，共获得21种物质。其中，在抗线虫辣椒品种‘青农簇生椒’中出现了感病辣椒品种‘农家小尖椒’根系分泌物中没有的酯类——DBP。本试验进一步分析了不同浓度的DBP处理的线虫孵化和二龄幼虫成活情况，随着DBP浓度的升高，南方根结线虫的生长和繁殖也均受到了抑制作用。结论认为辣椒根系分泌的化感物质DBP，在抑制南方根结线虫的生长和繁殖方面起到了积极作用。可以推测，轮作抗线虫辣椒根系分泌的化感物质BDP是防控西瓜根结线虫病害的可能机制之一。

本试验分析了抗性不同的两种辣椒根系分泌物处理南方根结线虫卵的孵化和根围二龄幼虫和卵粒数量的情况，结果表明，抗线虫品种‘青农簇生椒’根系分泌物对线虫孵化的抑制作用高于‘农家小尖椒’。‘青农簇生椒’辣椒分泌物处理的西瓜根内及根围根结线虫二龄幼虫和卵粒数量均低于‘农家小尖椒’。而两种辣椒材料均对根结线虫具有抑制作用，推测在辣椒根系分泌物中还有其他能够拮抗根结线虫的化感物质，且该物质同时存在于两种辣椒材料中，从而导致不含DBP的‘农家小尖椒’对线虫也有一定的抑制作用。