魏建行 梁荃 黄仕琼 李利华

(大理大学第一附属医院老年病科，云南 大理 671000)

心血管疾病导致的死亡约占中国人口死亡的40%以上，而高血压是心血管疾病最重要的危险因素，约有43%的心血管疾病发病可归因于高血压〔1，2〕。动脉硬化是高血压的发病基础，是与年龄相关的病理生理学过程，可以影响整个心血管系统的稳态。抗衰老因子(Klotho)是Kuro-O等〔3〕发现的一种抗衰老蛋白，主要表达于肾远曲小管和大脑脉络膜中。随着年龄增加，Klotho表达减少。Klotho基因敲除小鼠可出现多种与衰老相关的疾病，如动脉硬化、不育、皮肤萎缩、骨质疏松及肺气肿等〔3，4〕；而Klotho过表达则可通过胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)1途径延长寿命〔5〕。Klotho随着年龄增加表达减少可能在动脉硬化及高血压、肾脏疾病等发病中起重要作用〔6～9〕。然而，Klotho表达减少加速年龄相关的动脉硬化的机制尚不完全清楚。动脉钙化主要发生在中膜，在老年人中非常普遍，动脉钙化可加重动脉硬化，使动脉弹性下降。本研究通过用慢病毒体外干扰人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)中Klotho的表达，旨在探讨Klotho表达降低对细胞钙化和表型转化的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 HA-VSMC购于北纳生物公司，慢病毒购于上海吉玛基因，PCR引物购于上海生工生物工程有限公司，Klotho抗体购于Abcam，骨桥蛋白(OPN)购于Elabscience公司，钙离子检测试剂购于Elabscience公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞的培养及慢病毒转染 用含有15%FBS的高糖DMEM培养基培养HA-VSMC。用慢病毒shRNA干扰Klotho的表达。Klotho-2073 shRNA(shKlotho-2073)靶点序列为5′-GAGCCGTATACAAGGAATATG-3′；Klotho-1021 shRNA(shKlotho-1021)靶点序列为5′-CCGAGAGCATGAAGAATAACC-3′；Klotho-1207 shRNA(shKlotho-1207)靶点序列为5′-GGATTGACCTTGAATTTAACC-3′；阴性对照shRNA-NC(shNC组)靶点序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。……