张娟 岳卫华

0 引言

银是一种古老的抑菌剂，具有广谱、抗菌性强、耐药性低、使用安全等优点，属于非药物类物理抑菌剂[1]。银离子的抑菌机制主要有以下两种理论：

(1)接触反应机制。银离子到达病原菌表面时，依靠库仑引力穿透细胞壁进入胞内，干扰电子传输系统，破坏细胞内酶活性，凝固细胞蛋白质，破坏DNA分子等，导致病原菌细胞功能障碍而死亡[2]。

(2)催化反应机制。银离子具有催化活性中心的作用，能通过激活水或空气中的氧元素，产生羟基自由基及活性氧离子，活性氧离子能在短时间内破坏微生物的增殖能力，致使微生物细胞死亡[3]。目前，含银离子抑菌医疗器械产品已广泛应用于临床，在口腔护理、皮肤护理、预防导管相关感染等方面都具有良好的效果[4]。

随着我国老龄化的加剧，导尿管使用量急剧增多，尿路感染发生率也呈逐年上升趋势，如何减少尿路感染已成亟待解决的严峻问题。在预防留置尿管相关感染方面，研究发现银离子涂层导尿管对预防尿路感染具有很好的临床效果。田朝霞等[5]采用银离子亲水涂层的导尿管对实验组患者进行留置导尿，对照组采用普通导尿管，结果显示实验组患者泌尿道感染的发生率明显降低。黄慧敏[6]发现应用活性银离子抗菌凝胶外涂润滑导尿管后预防留置尿管相关尿路感染是简单有效的方法。

银离子水凝胶涂层导尿管是一种具有抗菌功能的改良导尿管，其设计原理是在普通导尿管基础上实施抑菌涂层处理，涂层的主要成分是具有高度活性的含银化合物，在人体内留置于尿道后可持续释放出具有抗菌活性的银离子，以期延缓致病菌生物膜形成或加速其分解，旨在减少尿路感染的发生率。按照我国《医疗器械分类及管理办法》，对于具有抗菌作用的功能性导尿管，归为三类医疗器械管理，对其临床试验、生物安全性能以及抑菌性能评价提出了更高的要求。

目前对于银离子涂层导尿管体外抑菌效力的研究主要有以下两种方法：采用抑菌环法进行抑菌效果的定性表征[7-8]，采用表面抑菌试验对抑菌效力进行定量分析[8-9]。鉴于银离子的抑菌作用，在对其抑菌效力进行定量测定时，应采用适宜的方法消除或中和其抑菌活性，并对其微生物计数方法进行方法适用性试验，以保证计数结果的准确和有效。由于目前尚无对银离子涂层导尿管抑菌效力定量检查中的微生物计数方法进行适用性验证的相关文献报道，本文拟依据《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版(四部通则1105)，通过方法适用性试验，针对银离子水凝胶涂层导尿管抑菌效力检查建立一种科学可行的微生物计数方法。

据文献报道，临床尿路感染的病原菌种类主要为大肠埃希菌，此外也存在由葡萄球菌、假单胞菌、念珠菌等病原菌导致的感染[10-11]。本文选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌等临床常见感染菌株，采用经适用性验证的微生物计数方法，依据《中国药典》2015年版(四部通则1121)对银离子水凝胶涂层导尿管进行抑菌效力的定量检查，可为该类产品的抑菌效力定量检查提供方法参考。

1 检测方法

根据《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”(四部通则1105)的规定，在对产品进行微生物计数时应进行方法适用性试验，向供试液中加入特定试验菌并对各试验菌逐一进行微生物回收试验并计算回收率。对于具有抑菌活性的产品，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤等多种方式处理以消除产品的抑菌作用。根据《中国药典》2015年版抑菌效力检查法(四部通则1121)的规定，微生物计数方法适用性试验中当微生物回收率不低于70%时，可认为通过该计数方法得到的计数结果是准确有效的，本文采用中和剂和薄膜过滤法联合使用的方式对供试液进行处理并进行微生物回收试验，建立适用于银离子水凝胶涂层导尿管的微生物计数方法，并照此建立的方法进行抑菌效力定量检查中存活菌数的测定。

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；生化培养箱(33℃，上海一恒科学仪器有限公司)；生化低温培养箱(23℃，上海一恒科学仪器有限公司)；立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；微生物过滤系统(杭州泰林生物技术设备有限公司)；涡旋振荡器(德国WIGGENS公司)。

1.1.2 测试样本

银离子水凝胶涂层导尿管(型号：三腔气囊；规格：22Fr 30 mL；批号：1903201、1903202、1903203，由企业提供)。

1.1.3 培养基与试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基TSA、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA(北京陆桥技术股份有限公司，规格250 g/瓶，培养基适用性检查结果均符合中国药典2015年版的要求)；磷酸盐缓冲液PBS(北京三药科技开发公司，规格100 mL/瓶)；D/E中和肉汤(美国BD公司，规格500 g/瓶)；0.9%无菌氯化钠溶液(四川科伦药业股份有限公司，规格100 mL/瓶)。

1.2 试验菌株

金黄色葡萄球菌[ATCC6538]、铜绿假单胞菌[ATCC9027]、大肠埃希菌[ATCC8739]、表皮葡萄球菌[ATCC12228]、白色念珠菌[ATCC19404]，均由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供，工作菌株均为第3代。

1.3 检测内容及测试方法

1.3.1 微生物计数方法适用性试验

(1)菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌至胰酪大豆胨琼脂培养基中，33℃培养24 h；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，23℃培养48 h；用0.9%无菌氯化钠注射液制成每0.1 mL含菌数小于100 cfu的菌悬液。

(2)供试液制备：采用无菌操作的方法截取银离子水凝胶涂层导尿管，剪成小段置无菌三角瓶中，按照每1 cm2涂层加入0.2 mL PBS缓冲液的比例，加入无菌PBS缓冲液，充分涡旋振荡后作为供试液，置20～25℃避光贮存。

留置导尿管的临床使用时间通常较长，本文拟选取1 d、2 d、3 d、7 d、14 d共计5个时间节点分别对导尿管的抑菌效力进行定量分析。由于导尿管涂层被洗脱后银离子是累积释放的，因此在微生物计数方法适用性试验中，需对避光贮存1 d、2 d、3 d、7 d和14 d的供试液分别进行微生物计数方法的适用性试验。

(3)试验各组设置如下。

试验组：取 “1.3.1(2)”项下供试液1 mL，加入D/E中和肉汤9 mL，然后加入“1.3.1(1)”项下制备的金黄色葡萄球菌菌液0.1 mL，充分涡旋混合，采用孔径0.45 μm滤膜全量过滤，用D/E中和肉汤冲洗滤膜，每膜冲洗量为300 mL，每次冲洗量不超过100 mL，取出滤膜贴于相应培养基平板上，置规定温度培养。铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌同法操作。每种试验菌每种培养基平行试验2次。

供试品对照组：以无菌PBS缓冲液代替试验菌液同试验组操作。每种培养基平行试验2次。

菌液对照组：取无菌PBS缓冲液10 mL，加入“1.3.1(1)”项下制备好的试验菌液各0.1 mL，同试验组操作。每种试验菌每种培养基平行试验2次。

中和剂对照组：以无菌PBS缓冲液代替供试液同试验组操作。每种试验菌每种培养基平行试验2次。

测定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌用TSA培养基，置33℃培养3 d；测定白色念珠菌用SDA培养基，置23℃培养5 d，分别菌落计数。

(4)回收率计算：试验组回收率(%)=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数×100%；中和剂对照组回收率(%)=中和剂对照组菌落数/菌液对照组菌落数×100%。

1.3.2 抑菌效力检查

(1)菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌至胰酪大豆胨琼脂培养基中，33℃培养24 h；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，23℃培养48 h；分别用0.9%无菌氯化钠注射液制成每0.1 mL含菌数约5×106～5×107cfu的菌悬液。

(2)供试液接种：采用无菌操作的方法截取银离子水凝胶涂层导尿管，剪成小段置无菌三角瓶中，加入无菌PBS缓冲液，每1 cm2涂层加入0.2 mL PBS缓冲液，充分振荡后作为供试液。

取按上述方法制备的供试液10 mL，接种“1.3.2(1)”项下制备的金黄色葡萄球菌试验菌液0.1 mL，使每1 cm2银离子水凝胶涂层上的初始接菌量为105～106cfu，每种试验菌平行接种5份供试液，充分涡旋混合，使供试液中的试验菌分布均匀，置20～25℃避光贮存。铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌同法操作。

取3个批次供试品平行试验。

(3)初始接菌量计算：取无菌PBS缓冲液10 mL，接种“1.3.2(1)”项下制备的金黄色葡萄球菌试验菌液0.1 mL，充分涡旋混合，梯度稀释后菌落计数，计算出相当于每1 cm2银离子水凝胶涂层中金黄色葡萄球菌的初始接菌量。铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌同法操作。

(4)存活菌数测定：在供试液接种试验菌1d时，分别取“1.3.2(2)”项下接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌的供试液各1份，取适量用无菌PBS缓冲液梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4四个梯度，分别取上述各梯度供试液各1 mL，加入D/E中和肉汤9 mL，采用薄膜过滤法全量过滤，用D/E中和肉汤冲洗滤膜，每膜冲洗量为300 mL，每次冲洗量不超过100 mL，取出滤膜贴于相应培养基平板上，置规定温度培养，计数。根据计数结果，计算1 mL供试液中各时间点的存活菌数，并换算成每1 cm2银离子水凝胶涂层中各时间点的存活菌数，同时计算抑菌效力(各时间点存活菌数与初始接菌量lg值的差值)。

供试液接种试验菌2 d、3 d、7 d、14 d时，分别另取“1.3.2(2)”项下接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌的供试液各1份，存活菌数测定同法操作。

2 检测结果

2.1 微生物计数方法适用性

微生物计数方法适用性试验中试验菌回收率测定结果见表1。结果表明，对20～25℃避光贮存1 d、2 d、3 d、7 d和14 d的供试液分别进行方法适用性试验并测定试验菌回收率，在3次平行试验中，试验组的试验菌回收率均大于70%，中和剂对照组的试验菌回收率均大于70%，说明银离子的抑菌活性已被有效中和，银离子抑菌性对微生物计数结果的影响已被有效消除，表明该试验条件下D/E中和肉汤的有效性和对微生物无毒性，由此得出的计数结果是准确有效的。因此，该计数方法经验证适用于银离子水凝胶涂层导尿管的微生物计数，可照此微生物计数方法进行银离子水凝胶涂层导尿管抑菌效力检查中存活菌数的测定。

表1 试验菌回收率测定结果(单位：%)

2.2 抑菌效力

抑菌效力试验中各试验菌存活菌数测定结果见表2，抑菌效力计算结果见表3。由结果可知，与初始接菌量相比，作用1 d时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的存活菌数减少的lg值均可达到2，相当于抑菌率达到98%；3 d时金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的存活菌数均小于1 cfu/cm2，7 d时铜绿假单胞菌存活菌数小于1 cfu/cm2，减少的lg值均大于5，相当于抑菌率达到99.9%以上，14 d时存活菌数均未增加。

表2 存活菌数测定结果

表3 抑菌效力计算结果(lg值)

作用1 d时，白色念珠菌减少的lg值可达到1，相当于抑菌率可达到90%；2 d时减少的lg值达到1.5，相当于抑菌率可达到96%；3 d时减少的lg值达到2.5，相当于抑菌率可达到99.7%；7 d时减少的lg值可达到2.8，相当于抑菌率可达到99.8%；14 d时减少的lg值相较7 d时变化不明显。虽然对白色念珠菌的抑菌作用稍差于其余4种菌，但抑菌率仍然能达到99%以上。

由此可见，导尿管水凝胶涂层中释放的银离子对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌均具有较好的抑制作用，而且抑菌作用持续时间可达到14 d。

3 讨论

微生物计数法是用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。根据《中国药典》微生物计数法(四部通则1105)的规定，当供试品具有抑菌活性时，在对其进行微生物计数时应尽可能去除或中和，通常采用的方法有培养基体积、加入适宜的中和剂或灭活剂、采用薄膜过滤法或上述几种方法的联合使用。银离子具有较强的抑菌性，因此对于含银离子的供试品进行计数时，应首先进行微生物计数方法适用性试验。

本文选取中和剂和薄膜过滤法联合使用的方法。D/E中和肉汤是一种特别的中和培养基，含有多种中和剂成分，例如硫乙醇酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、卵磷脂、吐温80等，可以有效中和多种抑菌物质对微生物的抑制和杀灭作用。将供试液与D/E中和肉汤按照一定比例混合后，采用薄膜过滤法过滤，再用适量D/E中和肉汤作为冲洗液对滤膜进行冲洗。结果表明，当供试液与D/E中和肉汤按照1∶9比例充分混合并且薄膜过滤，冲洗量为每膜300 mL、每次冲洗量不超过100mL时，银离子的抑菌活性可被有效中和，由此建立了适用于银离子水凝胶涂层导尿管的微生物计数方法，并照此方法进行该产品抑菌效力检查中存活菌数的测定，从而保证了抑菌效力结果的准确有效。

银离子水凝胶涂层导尿管对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌均具有较好的抑菌作用，抑菌率均可达到99%以上。但是从表2 和表3 的结果可知，与其余4种细菌相比，银离子对白色念珠菌的抑制作用稍差，推测与真菌和细菌的细胞组成结构不同有关，在今后的研究工作中可重点关注。

4 结论

采用D/E中和肉汤与薄膜过滤法联合使用的方式,建立适用于银离子水凝胶涂层导尿管的微生物计数方法，可照此方法进行抑菌效力检查中存活菌数的测定。本文建立的方法可用于银离子水凝胶涂层导尿管抑菌效力的定量检查，并可为具有抑菌作用的功能性导尿管产品的研发与性能改进提供技术支持，为临床使用提供数据支持，也为其他含银离子类医疗器械产品的性能评价提供方法参考。