李云龙 黄炳哲 李正伟 朴成东

0 引言

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)可以表达成骨因子和血管生长因子，对于成骨的形成有着重要作用[1]。学者们对BMSCs等干预治疗骨质疏松进行了大量的研究[2-8]，这些研究结果表明，骨质疏松动物通过BMSCs干预后，有利于成骨的形成。张泽华[9]以甲状旁腺激素(parathyroid，PTH)联合BMSCs干预大鼠骨质疏松后对大鼠骨组织形态进行观察，发现PTH联合BMSCs干预骨质疏松动物的效果比以PTH 单独干预骨质疏松动物的效果好。Uejima等[10]将BMSCs移植到骨质疏松模型大鼠的髓腔内，发现BMSCs移植大鼠的髓腔内后，骨密度得到了明显提高，骨的抗弯曲力学性能也有明显提高。Piao等[11]以BMSCs等干预骨质疏松动物后对其骨应力松弛、蠕变黏弹性特征进行分析，发现BMSCs干预可以改善骨质疏松大鼠的骨骼质量，恢复骨的黏弹性。

骨质疏松症的最主要临床并发症是以骨量丢失易好发骨折为表现形式，从生物力学角度分析，骨折是由于骨骼的抗剪切和冲击等力学性能降低所致。雷洛昔芬是预防和治疗骨质疏松的常用药品，对治疗骨质疏松具有一定的作用。对于以BMSCs、雷洛昔芬干预治疗骨质疏松后的剪切、冲击强度等力学性能是临床上医生关注的热点之一。目前以BMSCs、雷洛昔芬干预治疗动物骨质疏松后，采用剪切、冲击力学性能指标判断治疗效果罕见报道。作者提出这样的假设：骨质疏松后可能造成动物成骨细胞骨形成功能失衡，会使动物骨的抗剪切、冲击力学性能指标发生改变，骨质疏松模型动物通过以BMSCs、雷洛昔芬干预后，其抗剪切、冲击力学性能可能会得到一定的恢复。为验证此假设，本实验选择雷洛昔芬和BMSCs干预骨质疏松动物模型对比分析其治疗效果。实验分别以BMSCs、雷洛昔芬进行干预治疗骨质疏松大鼠后，取动物骨进行剪切、冲击实验和骨密度测试，取大鼠血清进行生物学指标测试，以骨的剪切、冲击、骨密度指标和血清生物学指标研判以BMSCs、雷洛昔芬干预治疗治疗骨质疏松的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

6月龄雌性SD大鼠88只，体质量241～246 g，由吉林大学新民校区动物实验中心(吉林长春)提供。随机分为骨质疏松动物模型组22只，正常对照组22只，骨质疏松动物模型以雷洛昔芬干预组22只，骨质疏松动物模型以骨髓间充质干细胞干预组22只。本实验得到吉林大学实验动物福利伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 骨质疏松大鼠模型及其干预治疗

以摘除大鼠卵巢法建立骨质疏松大鼠模型。首先将大鼠置于无菌环境下的动物手术床上，以2%的戊巴比妥钠注射液2 mL/kg 注射到大鼠的腹腔，对大鼠进行麻醉；之后在大鼠腹部正中部纵向切2.5 cm切口，逐层切入大鼠腹腔，沿着输卵管找到大鼠的卵巢，结扎输卵管后切除双侧卵巢。为预防感染，术后将105U 青霉素注入大鼠腹腔。骨密度(bone mineral density，BMD)是判断骨质疏的重要指标，为判断骨质疏松动物模型是否造模成功，于建模6周后随机取对照组和模型组10只大鼠L4椎骨，以美国明维思MindwaysQCT骨密度测量系统(美国得克萨斯州奥斯汀)测定其骨密度。结果表明，对照组骨密度为(171.8±8.2)mg/cm3，模型组骨密度为(131.4.±13.8)mg/cm3,模型组大鼠胫骨骨密度显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05),说明骨质疏松动物模型复制成功。

建模4周后，对BMSCs干预组大鼠通过尾静脉一次性注射大鼠BMSCs 3 × 106个(美国Sciencell公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥)。对雷洛昔芬干预组大鼠喂服雷洛昔芬(武汉江民华泰医药化工有限公司，中国武汉)。具体步骤：雷洛昔芬1片(60 mg)捣碎后投放到蒸馏水(60 mL)中制成浓度为 1 mg/mL药液。按照动物与人体表面积换算公式计算给药剂量(人体质量设为65 kg，大鼠体质量设为250 g)，雷洛昔芬干预组按照6.42 mg/(kg·d)每日早、晚各一次灌胃，连续给药42 d。

1.2.2 样本采集及实验步骤

对各组大鼠在给药42 d后行剪尾采血，每只大鼠采血20 mL,将采集的血样在空气中静置900 s之后以鑫中大离心机有限公司生产的XZD型低速离心机以2000 r/min的速度对血样离心20 min，取上清置于-20℃环境下存放。然后分别将每只大鼠置于动物手术床上，将准备好的2% 戊巴比妥钠注射液2 mL/kg 注射到大鼠的腹腔，麻醉后以断头法处死大鼠。取大鼠肱骨做骨密度测试，取大鼠股骨待做冲击实验，取大鼠胫骨做剪切实验。

1.2.3 大鼠骨试样包埋固定与几何尺寸测量

大鼠骨试样存放24 h后，取出各组大鼠胫骨、股骨试样，以日本奥林巴斯株式会社(日本东京)生产的STM7型测量显微镜测量各组试样的长度和直径。试样的长度为2.97～32.19 mm，试样的直径为1.87～1.99 mm。分别将每个胫骨和股骨的两端置于深度为5.5 mm、外径为9 mm、内径为4 mm的钢制模具后马上向模具中填充以牙托水稀释的牙托粉，待固化后脱模，取出试样。

1.2.4 检测指标

(1)生物学指标包括血清Ca、P、血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)。以库贝尔生物科技有限公司(广东深圳)生产的iChem-530型全自动生化分析仪化验血清ALP、P、Ca。

(2)肱骨BMD测量：从每组右侧肱骨中随机取10个，以MindwaysQCT骨密度测量系统测定肱骨骨密度。

(3)剪切实验：实验设备为深圳万测实验设备有限公司(广东深圳)生产的WANCHE电子万能试验机。随机取各组大鼠胫骨各10个试样，按参考文献[12-14]所述的方法分别对每个胫骨试样进行处理预调后，将试样分别装入胫骨剪切实验夹具内，放在试验机工作台上。驱动试验机以1 mm/min的实验速度通过夹具对胫骨试样进行剪切试验，试样破坏后，通过计算机获得剪切实验数据。

(4)冲击实验：小型冲击试验机为莱比锡试验仪器厂(德国莱比锡市)生产。随机取各组大鼠股骨各10个试样，按参考文献[12-14]所述的方法分别对每个股骨进行处理预调后，放在机器的支座上, 摆起试验机的摆锤后释放摆锤,将试样冲断, 测出每个试样的冲击功和冲击韧性。

1.3 统计学方法

2 结果及分析

2.1 各组大鼠P、ALP、Ca、BMD测量结果

各组大鼠P、ALP、Ca、BMD测量结果见表1。

表1 各组大鼠P、ALP、Ca、BMD测量结果(n=10)

实验结果表明，正常对照组BMD、Ca、ALP值大于以AMSCs组(P<0.05)，其血清P小于AMSCs干预组(P<0.05)。AMSCs干预组BMD、Ca、ALP值大于雷洛昔芬干预组, 其血清P小于雷洛昔芬干预组(P<0.05)。以雷洛昔芬干预组BMD、Ca、ALP值大于模型组, 其血清P小于模型组(P<0.05)，说明以AMSCs干预后，具有提高骨质疏松动物血清Ca、ALP、BMD，降低血清P的作用，有利于骨质疏松动物骨质的恢复。

2.2 各组大鼠胫骨剪切实验结果

各组大鼠胫骨剪切实验结果见表2。

表2 各组大鼠胫骨剪切实验结果(n=10)

实验结果表明，模型组最大载荷、最大应力、最大应变小于对照组、AMSCs组、雷洛昔芬干预组(P<0.05),AMSCs干预组最大载荷、最大应力、最大应变值大于模型组、以雷洛昔芬干预组(P<0.05)。说明以AMSCs干预后，具有提高骨质疏松动物胫骨的剪切强度的作用。

2.3 各组大鼠股骨冲击实验结果

各组大鼠股骨冲击实验结果见表3。

表3 各组大鼠股骨冲击实验结果(n=10)

实验结果表明，模型组冲击功、冲击韧性值小于对照组、AMSCs干预组、雷洛昔芬干预组(P<0.05), AMSCs干预组冲击功、冲击韧性值大于雷洛昔芬干预组(P<0.05)。说明以AMSCs干预后，具有提高骨质疏松动物股骨的冲击韧性的作用。

3 讨论

血清Ca的测定对骨矿代谢和钙磷代谢的研究具有重要价值[15]。血清P在骨矿物质中的作用之一是维持机械强度，ALP是反映成骨细胞的重要标志[16]。BMD是评价骨强度的基本指标[17]。骨质疏松大鼠通过以BMSCs干预治疗后，可起到恢复Ca、ALP、BMD值，提高骨量促进骨形成的作用。本实验发现大鼠骨的力学性能和BMD、血清Ca、血清ALP具有一定的关系，BMD、血清Ca、血清ALP恢复得越好，骨的剪切、冲击力学性能恢复得越好。

各组大鼠胫骨剪切实验结果表明，胫骨剪切实验试样破坏断口多数为横断口，少数为斜断口。模型组大鼠胫骨的剪切力学性能发生了改变。各组大鼠股骨冲击实验结果表明，股骨冲击试样破坏断口多数为粉碎性断口,与临床暴力损伤造成的粉碎性骨折相似。模型组大鼠股骨的冲击力学性能发生了改变。

骨生物力学是反映骨生长代谢情况的一个重要指标，是骨量、骨结构连续性、骨皮质厚度及骨的材料特性的综合指标。当骨的柔韧性减小，脆性增高，骨发生为骨折的概率相应增大[18]。本实验结果显示，骨质疏松动物模型通过以AMSCs干预治疗后改善了骨的结构，提高了骨的强度和韧性，与所期望的结果相符。

Wang 等[19]以切除新西兰家兔卵巢的方法复制骨质疏松动物模型，体外将新西兰白兔的BMSCs与藻酸钙凝胶混合，注入骨质疏松新西兰家兔股骨的远端，移植 8 周后进行大体形态学、组织学和骨组织力学检测，结果发现与单纯注射藻酸钙凝胶相比，MSCs-藻酸钙凝胶实验组在注射处理的局部组织处具有更多的骨组织，骨小梁密度增加，骨的拉力强度提高，这就证实 BMSC 对局部骨质疏松骨具有强化作用。Piao等[20]以骨髓间充质干细胞干预骨质疏松动物后对大鼠股骨进行应力松弛、蠕变生物力学等实验，结果表明，以骨髓间充质干细胞干预组7 200 s应力下降量大于模型组和阿仑膦酸钠干预组(P<0.05)，以骨髓间充质干细胞干预组7 200 s应变上升量大于模型组和以阿仑膦酸钠干预组(P<0.05)。因此得出以骨髓间充质干细胞干预后，骨质得到了一定的改善，其黏弹性力学特性得到一定的恢复的结论。本实验与参考文献Wang 等[19]、Piao等[20]研究不同的是，本实验以剪切、冲击生物力学指标和骨密度等生物学指标判断以BMSCs干预骨质疏松大鼠的效果,具有创新性。

Piao等[21]以骨髓间充质干细胞与阿仑膦酸钠干预骨质疏松大鼠后对大鼠股骨进行压缩等实验和骨密度、骨组织形态计量学参数指标测量，结果表明以骨髓间充质干细胞、阿仑膦酸钠干预，可使骨质疏松动物的代谢功能和骨的强度、韧性得到一定的提高。本实验是前期工作的连续，目的是系统研究以骨髓间充质干细胞等干预治疗骨质疏松动物，以血清生物学指标和动物骨的剪切、冲击力学指标判断骨髓间充质干细胞等干预治疗骨质疏松动物的效果，为骨质疏松的预防和治疗提供生物学和生物力学基础。

Ocarino 等[22]，将体外分离培养的同种异体BMSCs注入去势大鼠股骨,研究发现大鼠骨小梁表面绿色荧光蛋白阳性，ALT、胶原合成及矿化结节明显增高,而骨质疏松的大鼠其BMMSCs分化能力明显较健康对照组减弱；组织形态学检测发现大鼠股骨的骨量明显得到改善，说明骨髓间充质干细胞对于骨质疏松症的治愈具有非常重要的作用。本实验结果和参考文献[22]的结果表现出良好的一致性。

4 结论

骨质疏松动物模型通过以骨髓间充质干细胞干预后，血清生物学指标Ca、ALP、骨密度指标和骨的强度和韧性可以得到一定的恢复。