林伟青 林飞 王海东

（江西省人民医院 南昌330006）

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，而且近年来随着我国工业化及环境污染日益严重，发病率和死亡率上升明显，而且有低龄化的趋势。Tu H等[1]和Vieira AR等[2]根据流行病学的调查研究发现，多食用蔬菜水果可明显降低肺癌发生风险。近年来有许多有关中药抑制肿瘤的研究报道[3～4]。鼠曲草又名白艾、佛耳草、清明菜，是一种药食两用野生植物，味甘、性平，归肺经，被广泛用于各种疾病的治疗和保健，在中国民间已有几千年的使用历史，进一步研究开发其药用价值有着十分重要的意义。本研究尝试通过动物实验研究对比不同浓度鼠曲草提取液对大鼠肺癌形成是否存在抑制作用，初步探索鼠曲草对肺癌的预防机制。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取10～12周龄SPF级SD大鼠120只，体质量200～220 g，购自南昌大学医学院实验动物中心。随机分为对照组和高、中、低浓度组，每组30只。

1.2 试剂3,4-苯并芘购自美国Sigma公司；鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don）购自南昌大学第一附属医院药剂科中药房；鼠曲草水提取液由江西省人民医院制剂室自制，浓度分别为2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml；TUNEL试剂盒购自Roche公司。

1.3 研究方法

1.3.1 病理切片制备及观察 所有SD大鼠在实验室喂养1周以适应环境，灌注前以10%水合氯醛（100 mg/kg）行腹腔内注射麻醉，起效后取仰卧位固定，用细针经右侧胸廓中部穿刺至肺内，准确控制进针深度至针尖穿过胸壁入肺内2～3 mm处注入3,4-苯并芘玉米油混合溶液0.2 ml（含3,4-苯并芘2 mg），每周1次，共4次。对照组正常饮水，高、中、低剂量组分别以高、中、低浓度鼠曲草水提取液代水喂食，于第24周处死全部大鼠，取其肺组织标本，低温生理盐水洗净，10%甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片4～5μm，行苏木素-伊红（HE）染色，置显微镜下观察其病理变化。

1.3.2 原位末端转移酶标记（TUNEL）法检测癌细胞凋亡 具体步骤按说明书操作，切片按常规方法进行脱蜡，60℃烘片60 min后，用二甲苯脱蜡2次，乙醇水合作用（100%、95%、80%、75%）每次5 min；切片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min；样本浸泡于pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，微波中高火加热8 min左右，自然晾凉。再将切片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min；配制3%H2O2封闭液：80 ml甲醇加入10 ml H2O和10 ml H2O2（30%），即用即配；样本片浸入封闭液中，室温（15～25℃）封闭10 min；样本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μl TdT酶反应液，加盖玻片放入温盒中，37℃避光反应60 min（注：阴性对照样本不加TdT酶反应液）。反应后的样本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min，样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μl Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片放入温盒中，37℃避光反应30 min；反应后的样本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min。样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50 μl DAB工作液，室温显色反应30 s～5 min，显色后的样本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min。苏木素、甲基绿等常规染液复染（自备试剂）：将样本上滴加苏木素染液，染色30 s～5 min（在显微镜下观察确定），蒸馏水冲洗干净后浸入1%盐酸甲醇溶液中分化5 s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸洗5 min。用二甲苯浸2次，每次10 min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片，光学显微镜下观察拍照。光镜下凋亡细胞细胞核呈蓝黑色为阳性，每张切片随机选取5个高倍镜视野（200倍），每个视野计数100个细胞，每组3张共1 500个细胞，同时计数其中的阳性细胞数。凋亡指数（%）＝阳性细胞数/1 500×100%。

1.3.3 survivin检测 通过Light Cycler 480荧光定量PCR扩增仪采用巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）相对定量法检测肺癌大鼠肿瘤组织中survivin（280 bp）特异性mRNA条带并以β-actin（309 bp）为参照[5]。第一次反应使用中国上海Sangon生产的M-MLV一步法RT-PCR试剂盒测定β-actin（用作内部对照）和survivin。10μl RT-PCR反应系统分别包括2μg总核糖核酸（RNA），5μl 2×反应混合物，0.8μl正义链引物和反义链引物，0.2μl RT/Taq混合聚合酶和无菌双蒸水加入到10μl RT-PCR反应系统。反应条件：在43℃反应60 min，在70℃下反应15 min，在94℃加热以使反转录酶失活。survivin的反应条件：94℃变性30 s，53℃退火15 s，72℃延伸45 s，20个循环，然后在72℃温育5 min。β-actin的反应条件：94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环，然后在72℃温育5 min。其中没有RNA的反应体系用作阴性对比剂。第二次巢式反应通过使用MBI PCR试剂盒测定survivin，其模板由第一反应产生，以获得巢式PCR。20μl反应体系分别是：3μl模板，2μl 10×PCR缓冲液，0.5μl Taq酶，6.5μl双蒸水，2μl dNTP，2μl内部引物或巢式引物。反应条件：94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，然后在72℃温育5 min。用10μl扩增产物，以80伏电压进行2%琼脂糖凝胶电泳30 min，用溴化乙啶染色，然后分析用佳能GIS-1000数字凝胶照相系统获得的脱氧核糖核酸（DNA）电泳条。然后使用survivin与β-actin的比率作为存活蛋白表达水平的参数，以进行存活蛋白PCR产物的相对定量分析。引物序列。见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件，计数资料以%表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SD大鼠的肺癌成瘤率比较 实验过程中，由于麻醉过量、感染和恶病质，低浓度组大鼠死亡1只，对照组死亡1只，对照组在第24周肺癌成瘤率为72.41%（21/29），高、中、低浓度组大鼠肺癌成瘤率分别为36.67%（11/30）、43.33%（13/30）、55.17%（16/29），各组间肺癌成瘤率差异有显著性。说明鼠曲草提取液对肺癌的形成有明显抑制作用。

2.2 不同浓度鼠曲草提取液对细胞凋亡指数的影响 高、中、低浓度组大鼠肺癌细胞凋亡指数分别为（12.618 2±0.198 8）%、（11.348 7±0.182 8）%、（9.029 2±0.202 9）%；对照组肺癌细胞凋亡指数为（5.234 9±0.092 4）%；组间方差分析显示差异显著（P＜0.01），另相关性分析显示大鼠肺癌细胞凋亡指数与鼠曲草浓度呈正相关。见表2。

表2 原位末端转移酶标记法阳性细胞数

2.3 不同浓度鼠曲草提取液对大鼠肺癌组织中survivin表达的影响 高、中、低浓度组大鼠肺癌组织中survivin表达阳性率分别为81.82%（9/11）、84.62%（11/13）、87.50%（14/16）；对照组肺癌组织中survivin表达阳性率为95.24%（20/21），各组间差异不显著。而高、中、低浓度组大鼠肺癌组织中survivin表达强度分别为0.338 9±0.030 2、0.512 7±0.050 6、0.792 9±0.060 3；对照组肺癌组织中survivin表达强度为1.139 5±0.078 0；组间方差分析显示差异显著（P＜0.01），另相关性分析显示大鼠肺癌组织中survivin表达强度与鼠曲草提取液浓度呈正相关。见表3、图1。

表3 大鼠肺癌组织中survivin表达

图1 鼠曲草提取液对大鼠肺癌组织中survivin表达的影响

3 讨论

近年来我国肺癌发病率明显上升，与我国环境污染密切相关。苯并芘主要来源于煤焦油，各类碳黑、煤和石油等燃烧产生的烟气、汽车尾气、香烟以及焦化、炼油、沥青、塑料等工业污水中，是一种高活性致癌剂，也是大气致癌物的代表之一。故本实验采用3,4-苯并芘肺内注射诱导大鼠肺癌，该方法操作简单，实验周期短，成瘤率高。浓度配为10 mg/ml，每次0.2 ml，每周1次，共4次，取得了较为满意的成瘤效果。

鼠曲草在我国各地均盛产，以野生为主，也分布于日本、朝鲜、菲律宾、印度尼西亚、中南半岛、澳大利亚等。每年清明节前后民间都有使用鼠曲草的习俗，各地民间食用方法不一，但基本都是全草食用，可新鲜食用，也可晒干贮存，或水煮或拌入米面后食用，故有“清明菜、清明果”之称，是清明时节最早可食的野菜之一，营养丰富；同时也具有食疗作用，可治疗高血压、支气管炎、哮喘、风湿性腰痛等多种疾病，是民间传统营养健康的野生蔬菜，有“仙草”之称。本实验采用鼠曲草水煮提取液代饮用水喂食大鼠，与民间加工、食用方法相似，通过本实验证实鼠曲草水提取液有抗肺癌形成的功效。

鼠曲草具体成分十分复杂，含氨基酸、黄酮类化合物、挥发油、豆甾醇、生物碱等，据测定，鼠曲草全草含5%黄酮甙。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗突变、保肝等作用，有保护心脑血管系统、抗病毒以及杀虫等广泛的生理活性，且毒性较低[6～7]。Kozlowska J等[8]从新鲜鼠曲草花的甲醇提取物中分离得到一种新查耳酮和两种黄酮类物质，2',4,4'-三羟基-6-甲氧基查耳酮（2',4,4'-trihydroxy-6'methoxychalcone）、木犀草素（luteolin） 和木犀草素-4'-D-葡萄糖苷（luteolin-4'-D-glucoside）。ChatsumpunN等[9]从鼠曲草中分离提取到4,4',6'-trihydroxy-2'-methoxychalcone、5,6-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone、5-hydroxy-3,6,7,8-tetramethoxyflavone、5-hydroxy-3,6,7,8,4'-pentamethoxyflavone等黄酮类化合物。Ahmady A等[10]从单花鼠曲草（Gnaphalium uniflorum Lan）乙醇提取液中分离提取得到6种黄酮类化合物，分别是槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside-4'-O-β-D-glucopyranoside）、芦丁（rutin）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（quercetin-3-O-β-D glucopy ranoside）、异鼠李黄素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（isorhamnetin-3-O-β+D-galactopy ranoside）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol），通过LP-LUV实验、DPPH实验和UV-IP实验证实了单花鼠曲草乙醇粗提物（ECR）及其主要黄酮类成分具有抗氧化作用、体外自由基清除及体内光防护等作用。Cho HJ等[11]研究结果显示，木犀草素可通过激活p38/ROS/半胱天冬酶级联来诱导肺癌细胞凋亡。Kasala ER等[12]研究发现口服木樨草素可通过降低苯并芘诱导肺癌的瑞士小白鼠体内脂质过氧化物，提高抗氧化物水平，还能有效降低苯并芘诱导的增殖细胞核抗原（PCNA），细胞色素P450 1A1和核因子κB，从而得出结论，木犀草素具有预防苯并芘诱导的肺癌潜在作用。

本课题组前期实验[13]从鼠曲草中分离得到8个化合物，分别为β-谷甾醇、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异泽兰黄素、5-羟基-6,7,3,4-四甲氧基黄酮、槲皮素、木犀草素和芹菜素。其中鼠曲草中异泽兰黄素（eupatilin）和5-羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮为首次从鼠曲草属植物中分离得到，芹菜素（apigenin）为首次从该植物中分离得到。据国外研究报道鼠曲草成分中多种成分如apigenin[14～15]和eupatilin[16]等有较强的抗肿瘤作用。

本研究结果发现，鼠曲草水提取液具有良好的抗肿瘤作用，且与其浓度相关；其作用机制可能主要与其抗氧化作用和自由基清除作用等相关，另外其促进肿瘤细胞凋亡的作用也是其抗肿瘤作用形成的关键，这与国内外相关报道一致。进一步从鼠曲草水提取液中找出其抗肿瘤的有效成分及其作用机制是摆在我们面前的一项难题，还需要进行相当繁琐艰巨的实验研究工作。