樊雨梅，帖航，张筱梒，史传超，苏宁，廖峰*

（1.国家胶类中药工程技术研究中心，山东 聊城 252201；2.东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252201；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

畜禽骨作为肉制品加工行业的主要副产物，约占动物体重的20%～30%[1]。据统计，2018年我国肉类总产量为8 624.63万吨[2]，约产生1 725万吨～2 587万吨畜禽骨，这些畜禽骨处理不当将会给环境和经济带来巨大的负担。对畜禽骨进行适当的处理，生产增值的原料或产品，不仅提高了畜禽骨的价值，而且还避免了环境污染。但是，目前我国畜禽骨大多被丢弃或用于制骨汤或加工低价值产品（骨粉、骨泥等），深加工利用率很低[3]。因此，高价值利用畜禽骨成为当今主要的研究内容。

针对畜禽骨的研究主要集中在胶原蛋白和生物活性肽的提取工艺优化、产业化应用、功效研究，目的是将畜禽骨用作功能性食品、化妆品、生物医药等领域的高附加值原料。大量的研究表明，利用蛋白酶水解得到的畜禽骨生物活性肽具有多种生物活性功能，比如抗骨质疏松[4-5]、降血压[6-7]、抑菌[8-9]、抗疲劳[10-11]、抗氧化[12-13]和促进伤口愈合[14-15]等。我国是家驴主产国之一[16]，但是目前对畜禽骨开发集中在猪[17]、牛[18]、牦牛[19]、羊[20]、鹿[21]、鸡[22]等畜禽骨，对驴骨的开发利用研究较少。驴骨作为我国的传统药物有着广泛的药用记载，动物骨骼药效可能与所含有的骨胶原、软骨素等活性成分有关，为精准提取独特的驴骨生物活性肽，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF/MS）方法分析驴骨蛋白质组成，并通过基因本体论（gene ontology，GO）分类法对检测到的蛋白质进行归类，揭示驴骨蛋白生物学功能，为今后驴骨生物活性肽的提取及功能研究提供一定的理论依据和试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驴骨：山东天龙驴产业研究院；乙腈、甲醇、甲酸（均为质谱纯）：百灵威科技有限公司；Tris-base：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、尿素、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、考马斯亮蓝R-250（生物级）、十二烷基硫酸钠：北京索莱宝科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；两性电解质缓冲液（Bio-Lyte 3-10，20%）、固相化pH梯度（immoblized pH gradients，IPG）胶条（ready strip，7 cm，pH 3-10）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）maker：美国Bio-Rad公司；测序级胰蛋白酶（70 U/mg蛋白）：普洛麦格（北京）生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

MALDI-TOF/TOF-MS质谱仪（Autoflex speed）：美国Bruker Daltonics公司；SDS-PAGE电泳仪（Mini Protean 3 Cell）、2-DE 电泳仪（Protean IEF cell）：美国 Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 驴骨素样品的制备

防疫检验、微生物检验合格的鲜骨，经破碎、蒸煮提取、过滤、浓缩、喷雾干燥后，制成驴骨素样品。精密称取制备的驴骨素粉末10.000 0 g，加入100 mL pH 8.0含100 mmol/L氯化钠的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，在80℃下浸提60 min，待样品冷却至室温25℃后，10 000 r/min离心30 min，取中间层澄清溶液，即为10%待测驴骨素溶液。

1.3.2 蛋白质特性的测定

1.3.2.1 BCA法测定蛋白质含量

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒上的方法检测驴骨胶原蛋白的蛋白质含量。

1.3.2.2 SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量范围

根据帕尔哈提·柔孜等[23]的方法稍作修改。10%驴骨胶原蛋白溶液稀释10倍后，加入等量的含DTT的2×上样缓冲液，充分混匀，沸水浴5 min。浓缩胶质量分数为5%，分离胶12%。上样量为10 μL，将凝胶扫描电子图谱保存，电泳所用的marker分子量范围在10 kDa～250 kDa。

1.3.2.3 二维电泳分析蛋白质等电点范围

方法参考文献[24]，略有改动。200 μL 10%驴骨胶原蛋白溶液与800 μL的水化液混匀。取200 μL加载到电泳池，等点聚焦程序见表1。

表1 7 cm胶条的IEF程序Table 1 IEF program for 7 cm latex

等电聚焦后立即进行胶条平衡。平衡分两步，每次15 min，分别使用5 mL含1%DTT平衡液和5 mL含2.5%碘代乙酰胺平衡液。将平衡好的胶条放置于浓度为12%聚丙烯酰胺凝胶上，并用1%的琼脂糖固定胶条，进行第二向电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色后，以脱色液脱去背景颜色，使用凝胶成像设备扫描成电子图片保存。

1.3.3 蛋白质组成的分析

驴骨胶原蛋白经SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝R-250染色，将条带对半切开，转移至EP管中。蛋白质的脱色酶切方法参考文献[25]。浓缩液与基质混合后，采用MALDI-TOF/TOF-MS分析。利用Mascot软件的SwissPort数据库进行搜索。检索分类（Taxonomy）为 Equus caballus，Mascot检索 p＜0.05 和 Mascot得分＞41分的结果被认为鉴定成功。

1.3.4 利用GO法对蛋白进行归类

通过GO法对以检测蛋白质分别以其分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞组成（cell component，CC）3 种方式进行归类，揭示驴骨素蛋白生物学功能。再对驴骨素蛋白进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，寻找驴骨素蛋白集中的生物学信号通路。

1.4 数据分析

以3次重复试验每次同时做平行试验所得的数据为结果，用均值表示。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的基本性质

2.1.1 蛋白质含量的分析

利用BCA法测定驴骨素蛋白的蛋白质含量为47.82 g/100 g，小于刘楚怡等[26]报道的驴骨胶原蛋白含量57.3 g/100 g，可能是由于凯氏定氮法主要测定的是样品中总氮含量才导致的结果偏高。

2.1.2 蛋白质分子量的分布

利用SDS-PAGE凝胶电泳检测驴骨素蛋白的分子量分布见图1。

图1 驴骨胶原蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE of donkey bone extract

由图1可知，驴骨素蛋白分子量在10 kDa～250 kDa之间呈弥散性分布，与马国霞等[27]、张崟等[28]报道的猪骨素蛋白电泳条带一致，可能是由于加工过程中蛋白质降解降解程度偏低，没有形成清晰的条带导致的。因驴骨素加工过程中一般使用高温蒸煮，导致蛋白质水解不彻底，使蛋白质分子呈弥散型。

2.1.3 蛋白质等电点

驴骨素的2-DE电泳结果如图2所示。

图2 驴骨素蛋白2-DE电泳结果Fig.2 2-DE of donkey bone extract

由图2可知，水平方向为第一固相pH梯度等点聚焦，垂直向为第二向垂直板SDS-PAGE电泳，驴骨素蛋白的等电点主要集中在4.5～6.5之间，说明驴骨素蛋白结构中的酸性氨基酸及中性氨基酸较多。驴骨素也有微量蛋白质在碱性区域。

2.2 蛋白质组成的分析

利用SDS-PAGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，总共鉴定出89种蛋白质，其中有21种未命名蛋白，剩余68种蛋白分析结果见表2。

表2 驴骨素蛋白质组分分析结果Table 2 Analysis of components in donkey bone extract protein

续表2 驴骨素蛋白质组分分析结果Continue table 2 Analysis of components in donkey bone extract protein

2.3 蛋白质GO分类和KEGG通路分析结果

利用在线生物信息数据库DAVID（http：//david.ncifcrf.gov，6.7版本）对驴骨素所含有的89种蛋白进行GO分类，结果见图3。

从细胞组成分析可知，驴骨素蛋白参与的细胞组分主要是角蛋白纤维（GO：0045095）、外泌体（GO：0070062）、血液微粒（GO：0072562）、胶原三聚体（GO：0005581）、细胞体 （GO：0044297）、丝状体（GO：0030175）、核小体（GO：0000786）、细胞周边（GO：0071944）、蛋白质细胞外基质（GO：0005578）、细胞核（GO：0005634）、片状伪足（GO：0030027）、细胞外区域（GO：0005615）、核小体（GO：0000788）、I型胶原三聚体（GO：0005584）、致密体（GO：0097433）、肌节（GO：0030017）、钙通道复合体（GO：0034704）。

驴骨素蛋白参与的生物过程主要包括间充质迁移（GO：0090131）、胶原原纤维组织（GO：0030199）、氨基酸刺激的细胞反应（GO：0071230）、核小体组装（GO：0006334）、视网膜稳态（GO：0001895）、基因表达的正调控（GO：0010628）、环核苷酸磷酸二酯酶活性的正调控（GO：0051343）、环核苷酸代谢过程的正调控（GO：0030801）、软骨内骨形态发生中的软骨发育（GO：0060351）、丹参碱敏感性钙释放通道活性的正向调控（GO：0060316）、骨骼肌细丝组件（GO：0030240）、毛发周期（GO：0042633）、中间丝细胞骨架组织（GO：0045104）、角化作用（GO：0031424）、皮肤形态发生（GO：0043589）、内质网调节螯合钙离子向细胞质释放（GO：0010880）、钙离子的识别（GO：0005513）、衰老（GO：0007568）、磷蛋白磷酸酶活性的正向调节（GO：0032516）、蛋白质异源三聚（GO：0070208）等。

图3 驴骨素蛋白GO分类结果Fig.3 GO classification of protein in donkey bone extract

驴骨素蛋白参与的生物过程分子功能主要是结构分子活性（GO：0005198）、核小体DNA结合（GO：0031492）、细胞外基质结构成分（GO：0005201）、蛋白磷酸酶激活剂活性（GO：0072542）和氧结合（GO：0019825）。

对驴骨素蛋白进行KEGG的生物通路富集分析，以推断它们参与的信号通路，结果见图4。

图4 驴骨素蛋白KEGG生物通路富集分析结果Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of protein in donkey bone extract

驴骨素蛋白主要参与信号通路包括血小板激活（ecb04611）、黏附斑（ecb04510）、酒精中毒（ecb05034）、蛋白质的消化与吸收（ecb04974）、ECM受体相互作用（ecb04512）、阿米巴病（ecb05146）、系统性红斑狼疮（ecb05322）、血管平滑肌收缩（ecb04270）、催产素信号通路（ecb04921）、癌症中的转录失调（ecb05202）、PI3KAkt信号通路（ecb04151）、肥厚性心肌病（ecb05410）、Rap1信号通路（ecb04015）和扩张型心肌病（ecb05414）。其中，PI3K-Akt信号通路是胰岛素发挥代谢调节作用的主要信号转导途径，其任何一个环节异常均会干扰胰岛素的生理功能，进而导致2型糖尿病及其并发症的发生[29]。相关研究也证实[30]，Rap1信号通路参与糖尿病肾病的发生。这些研究成果从分子生物学角度解释了《本草纲目》中关于驴骨“牝驴骨煮汁服，治多年消渴，极效”的记载。

3 结论

本文旨在研究驴骨素蛋白质的性质和组成，为提取具有特征生理活性的驴骨生物活性肽提供理论依据。采用SDS-PAGE、二维电泳和MALDI-TOF/TOF/MS等手段揭示驴骨素蛋白的性质与组成，并通过GO分类法对检测到的蛋白质进行分类，同时，对驴骨素蛋白进行KEGG信号通路富集分析。研究表明，驴乳粉蛋白质的含量为47.82 g/100 g，分子量在10 kDa～250 kDa间呈弥散型分布，等电点均匀分布在4.5～6.5之间。通过与马科蛋白图库进行对比，共识别出89种蛋白。利用GO分类法对89种蛋白质进行分类，发现驴骨素蛋白主要参与构成的细胞组分包括角蛋白纤维、外泌体、血液微粒、胶原三聚体、细胞体、丝状体等，参与的生物过程主要包括间充质迁移、胶原原纤维组织、氨基酸刺激的细胞反应、核小体组装、视网膜稳态、基因表达的正调控、软骨内骨形态发生中的软骨发育等，参与的分子功能包括结构分子活性、核小体DNA结合、细胞外基质结构成分、蛋白磷酸酶激活剂活性和氧结合。KEGG的生物通路富集分析结果显示驴骨素蛋白主要参与了血小板激活、黏附斑、蛋白质的消化与吸收等14条信号通路，其中PI3K-Akt信号通路和Rap1信号通路的识别从分子机制角度解释了驴骨治疗糖尿病的可能机制。这些研究成果为驴骨素生物活性肽的提取和功能研究提供了一定的理论依据和试验基础。