刘 宏 易娅静 于 颖 代巧妹 张雨薇 杨 婧 张 博 仲丽丽

1.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学博士后流动站，黑龙江哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学研究生学院，黑龙江哈尔滨 150040；4.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨 150040；5.黑龙江中医药大学第一附属医院，黑龙江哈尔滨 150040

卒中后神经损伤是致残的主要原因[1]。脑卒中是一种具有两性差异的疾病，女性患脑卒中的风险比男性低。然而，这种保护作用在绝经后由于内源性雌激素的丢失而减弱。雌激素替代疗法在实验研究和临床试验中存在争议[2-4]。古方左归丸出自《景岳全书》，具有填精髓、补肾阴之效[5]。在临床被用于治疗肝肾阴虚型脑梗死恢复期、脑供血不足型眩晕、脑卒中后遗症患者呈反复头晕、头痛伴手足麻木、腰酸耳鸣、记忆力减退等属肾精亏损、髓海空虚诸症[6-7]。中医学认为，“肾主生殖”[8]，肾的部分功能相当于现代医学“下丘脑-垂体-性腺轴”[9]的功能。有实验显示[10]左归丸可明显提高去卵巢大鼠海马ERβ 表达，改善其惊恐反应，并可通过上调海马组织及齿状回神经生长因子（NGF）水平来延缓大鼠衰老[11]。本课题组前期实验证实，左归丸还可以通过上调脑源性神经营养因子（BDNF）水平改善受惊吓大脑中动脉阻塞（MCAO）大鼠的缺血再灌注损伤[12]。然而，左归丸预处理是否通过雌激素受体介导的BDNF 和NGF 信号通路改善脑缺血再灌注损伤仍不清楚。本研究探讨左归丸是否通过调节雌激素受体（estrogen receptor，ER）信号通路发挥神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性SD 大鼠，SPF 级，8～10 周龄，170～230 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠置于笼内[温度（22±1）℃，湿度45%～55%]，12 h 灯/12 h 暗循环，允许随意获取食物和水。所有实验方案均符合黑龙江中医药大学医学伦理委员会批准的《实验动物饲养与使用规范》。

1.2 主要药物和试剂

左归丸（北京同仁堂药店，批号：070503）；17β-雌二醇（Beyotime，货号：MB1098）；ICI182780（medchemexpress，货号：HY-13636）；anti-ERα（Proteintech Group，货号：21244-1-AP）；anti-ERβ（Sangon Biotech，货号：14007-1-AP）；anti-BDNF（Sangon Biotech，货号：D121057）；anti-NGF（Boster，货号：BA0611-2）；antip-CREB（Bioss，货号：bs-0036R）；anti-TrkB（Bioss，货号：bs-0175R）；anti-TrkA（Bioss，货号：bs-0193R）；βactin（Bioss，货号：bsm-33139M）。

1.3 分组

采用随机数字表法将大鼠分为六组（n=18）：假手术组（只切口不插栓线）、I/R 组（Longa 线栓法行MCAO 手术）、OVX+I/R 组（卵巢摘除+MCAO 手术）、OVX+I/R+Zuogui Pills 组（卵巢摘除+MCAO 手术+左归丸1.62 g/kg，灌胃）、OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780组（卵巢摘除+MCAO 手术+左归丸灌胃+ICI182780 3 mg/kg，腹腔注射）、OVX+I/R+17β-estradiol 组（卵巢摘除+MCAO 手术+17β-estradiol 100 μg/kg，腹腔注射）。用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，在大鼠腹部正中开小切口，行双侧卵巢摘除术（ovariectomy，OVX），术后，缝合皮肤。假手术组大鼠只切口不摘除双侧卵巢。OVX 后3 d，OVX 雌性大鼠给予无色溶剂（DMSO）、17β-estradiol（100 μg/kg）腹腔注射[13]，1.62 g/kg 左归丸汤剂灌胃，连续5 d。第7 天线栓法[14-15]行MCAO 手术，1 h-MCAO，再灌注24 h。OVX+MCAO+Zuogui Pills+ICI182780 组给予ER 拮抗剂ICI182780（3 mg/kg，腹腔注射）[16]。假手术组大鼠行无大脑中动脉闭塞的假手术（不栓线）。假手术组、I/R 组及OVX+I/R 组大鼠均给予等量DMSO 注射液。

MCAO 致麻醉大鼠短暂脑缺血[17]。麻醉后行颈中线切口，将18～19 mm 的单丝插入大脑中动脉，以封堵大脑中动脉。闭塞1 h 后，通过移除单丝，大脑血流恢复（再灌注）24 h。再灌注后进行神经学评估和新奇物体识别试验。然后，将脑组织切除并进行免疫印迹实验。

1.4 模型筛选：神经功能缺损评估

再灌注后（第8 天），根据Garcia 及其同事描述的方法用神经功能评分评估神经功能缺损[18]。该评估系统由6 个测试组成，包括自发活动、前爪伸展、四肢运动的对称性、振动触觉反应、身体本体感觉和攀爬。每个项目的分数范围0～3 分，最高分是18 分。

1.5 新奇物体识别实验

再灌注后进行新奇物体识别实验。这项测试利用了动物天生的倾向，即优先探索新事物。简单地将大鼠置于含有A、B 两个相似物体（颜色、大小、形状）的笼中，在MCAO 前4 d 每天训练20 min。于MCAO 后2 h，大鼠被允许探索对象A 和B，勘探时间记录5 min。24 h，对象B 被换做一个新的物体C，让大鼠在熟悉的物体A 和陌生的物体C 之间进行探索，同样记录5 min 物体的探索时间。在这个测试中，探索被定义为物理定位/操作和观察对象（从鼻子到观察对象的距离＜2 cm）。

1.6 免疫蛋白印迹

脑组织于含1%PMSF 的RIPA 裂解液中冰裂解5 min。4℃，离心，收集上清液测定蛋白浓度。分离的蛋白带转移到微孔PVDF 膜上。主要抗体在4°C 孵育一夜。抗体有anti-ERα（1∶1000），anti-ERβ（1∶500），anti-BDNF（1∶500），anti-NGF（1∶500），anti-p-CREB（1∶500），anti-TrkB（1∶500），anti-TrkA（1∶500）。HRPlabeled 二抗（1∶5000）在37℃孵育45 min。Gel-Pro 分析仪分析。β-actin（1∶500）被用作内参。

1.7 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。计数资料以例数表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的神经功能和认知能力比较

与假手术组比较，I/R 组神经功能评分及探索指数下降（P ＜0.05）。与I/R 组比较，OVX+I/R 组各指标下降 （P ＜0.05）。与OVX+I/R 组比较，OVX+I/R+Zuogui Pills 组、OVX+I/R+17β-estradiol 组各指标升高（P ＜0.05）；与OVX+I/R+Zuogui Pills 组比较，OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780 各指标下降（P ＜0.05）；OVX+I/R+Zuogui Pills 组与OVX+I/R+17β-estradiol组各指标比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1。

2.2 各组大鼠海马ERα 和ERβ 水平比较

图1 各组感觉运动功能和识别记忆能力比较

ERα、ERβ 表达在细胞核，棕黄色为阳性染色。在每张切片海马区选择10 个表达强的高倍视野（400×）计阳性细胞数。与假手术组比较，I/R 组海马区ERα和ERβ 水平升高（P ＜0.01）。与I/R 组比较，OVX+I/R组海马区ERα 和ERβ 水平下降（P ＜0.01）。与OVX+I/R 组比较，OVX+I/R+Zuogui Pills 组、OVX+I/R+17βestradiol 组海马区ERα 和ERβ 水平升高（P ＜0.01）；与OVX+I/R +Zuogui Pills 组 比 较，OVX +I/R +Zuogui Pills+ICI182780 海马区ERα 和ERβ 水平下降 （P ＜0.01）；OVX+I/R+Zuogui Pills 组与OVX+I/R+17β-estradiol 组海马区ERα 和ERβ 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2～4。

图2 ERα 在海马的表达（DAB 染色，400×）

图3 ERβ 在海马的表达（DAB 染色，400×）

2.3 各组大鼠海马BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB 和CREB 蛋白及mRNA 水平比较

与假手术组比较，I/R 组BDNF、NGF、TrkA 蛋白表达水平升高 （P ＜0.01）；NGF、TrkA mRNA 表达水平升高（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与I/R 组比较，OVX+I/R组大鼠各指标（除CREB 外）水平下降（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与OVX+I/R 组 比 较，OVX+I/R+Zuogui Pills 组、OVX+I/R+17β-estradiol 组各指标 （除CREB外） 水平升高（P ＜0.05 或P ＜0.01）；与OVX+I/R+Zuogui Pills 组比较，OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780组各指标 （除CREB 外） 水平下降（P ＜0.05 或P ＜0.01）；与OVX+I/R+Zuogui Pills 组比较，OVX+I/R+17β-estradiol 组各指标（除CREB 外）水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图5～6。

3 讨论

内源性雌激素缺乏会增加绝经后妇女的卒中风险[19]。对于缺血性脑卒中的预防和治疗具有重要意义。本课题组以往研究已经证明左归丸可以改善缺血性脑损伤大鼠的记忆功能[20-21]。本研究结果同样显示，左归丸能够减轻OVX 大鼠在MCAO 后感觉运动功能和识别记忆的损伤。这个神经保护作用左归丸与17β雌二醇相似。

ERα、ERβ，雌激素受体的两个重要的亚型，调节细胞生长，生存和新陈代谢，调节下游目标的表达[22]。Shin 等[23]研究显示，ERs 参与了OVX 小鼠MCAO 诱导的缺血性脑损伤。左归丸是否改善了脑I/R 损伤由调制ERα 和ERβ 仍不清楚。在本研究对左归丸预处理缺血后脑损伤大鼠进行ERα 和ERβ 检测，结果发现，MCAO 手术不能让卵巢摘除的大鼠ERα、ERβ 表达增加，如果补充17β 雌二醇可以上调ERα 和ERβ 水平。结果显示，脑内ERs 的升高可能是I/R 损伤的互补效应之一。这种互补作用可能由于雌激素缺乏而受到损害引起的。有趣的是，本研究发现左归丸治疗后脑内ERα 和ERβ 重新上调，这种对ER 表达的刺激作用与17β 雌二醇相似。因此，本研究显示，与外源性雌激素一样，左归丸也通过调节ER 信号通路发挥神经保护作用。

图4 各组大鼠海马的ERα 和ERβ 及β-actin 蛋白的免疫印迹图

图5 各组大鼠海马BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB和CREB及β-actin 蛋白的免疫印迹图

NGF 是第一个被发现的神经营养因子（neurotrophins，NTs），在海马和皮层中表达。据报道，通过与TrkA 结合促进中枢和外周神经系统神经元的存活和分化[24]。活性的NGF-TrkA 信号进一步触发ERK 的磷酸化，激活其下游蛋白CREB，导致学习记忆能力的提高[25]。BDNF 是一种神经营养因子，最初从猪脑中提取，广泛表达于中枢神经系统[26]。BDNF 与其受体TrkB 结合，通过激活下游信号通路发挥促神经元生存作用[27-28]。此外，往期研究显示[29-30]，左归丸可以通过调节BDNF和NGF 防治神经退行性疾病、糖尿病性视网膜病变和β-淀粉酶诱导的神经毒性损伤。本研究结果显示，左归丸可以激活BDNF-TrkB 和NGF-TrkA 信号通路。

图6 各组大鼠海马BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB和CREB mRNA 水平

已有研究显示，一种新的植物雌激素可通过ER 依赖的Akt/Nrf2 通路或ER 依赖的内质网应激通路减轻脑I/R 损伤或新生儿脑缺血缺氧损伤[31-32]。因此推测，左归丸可能通过ER 依赖的BDNF-TrkB 和NGFTrkA 信号通路，保护OVX 大鼠的大脑I/R 损伤。为了研究ERs 在左归丸神经保护效应中的作用，本研究进一步使用ER 拮抗剂ICI182780 来阻断左归丸存在时的ER 信号通路。结果显示，ICI182780 注射增加神经功能受损和认知能力损害，增加脑梗死面积、诱导神经元损失，降低ERα/β 水平，抑制了左归丸对BDNF-TrkB 甚至NGF-TrkA 的促进作用。这些数据显示，ER 介导的BDNF-TrkB 和NGF-TrkA 信号通路是左归丸神经保护作用的关键通路。