叶惠荣 袁惠玲 曹 茵 王西跃 吴丽华 陈桂林 陈丽娟 张玉娟

广东省东莞市人民医院乳腺科，广东东莞 523000

微RNA（miR）-221/222 定位于人染色体Xp11.3[1]，两者核心种子序列（68～72）完全同源，同时抑制miR-221/222 可抑制乳腺癌[2-3]、胶质瘤[4-5]等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。研究显示[6]，耐药乳腺癌组织中miR-221/222 表达上调，但抑制miR-221/222 是否可增加三阴性乳腺癌（TNBC）的铂类药物敏感性目前较少见报道。鉴于此，本研究观察了抑制miR-221/222 对TNBC MDA-MB-231 细胞顺铂（DDP）敏感性的影响，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

细胞株：TNBC MDA-MB-231 细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC）细胞库，编号：TCHU202，第2 代细胞。

试剂：miR-221 抑制剂、miR-222 抑制剂和miR-221/222 抑制剂（上海吉玛制药技术有限公司，货号：B05001）；MTT 检测试剂盒（美国Trevigen 公司，货号：4890-25-01）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0220）；Caspase-9、Bax、Bcl-2 一抗（美国Imgenex 公司，IMG-5709）。

仪器：GENios 多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司）；7900HT 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI 公司）；E10001 电泳槽（美国Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组和转染 取对数生长期的MDA-MB-231 细胞，将其随机分为对照组、miR-221 抑制组、miR-222 抑制组和miR-221/222 抑制组，分别转染空白试剂、miR-221 抑制剂、miR-222 抑制剂和miR-221/222 抑制剂，转染后均给予DDP 5 μg/mL 进行细胞培养[7]。

1.2.2 荧光定量PCR 检测miR-221/222 mRNA 相对表达量 转染后24 h 时用Trizol 提取各组细胞的总RNA，采用荧光定量PCR 法检测各组MDA-MB-231细胞中miR-221/222 mRNA 的相对表达量，miR-221上 游：3’-ACACTCCAGCTGGGACCTTGGCATACA -ATGT-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCT-5’；miR-222 上游：3’-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTA-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCAG-5’；以U6 为内参（上游：3’-CTCGCTTCGGCAGCACA-5’，下游：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’），逆转录反应操作均按照Takara036A（mRNA）/037A（micro RNA）公司逆转录试剂盒说明书进行，反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）5.0 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.2 μL，DNA 模板（上述逆转录产物）1.0 μL，dH2O 2.8 μL，Total 10.0 μL，反应体系20.0 μL，扩增条件37℃15 min，85℃5 s，4℃1 min，共40 个循环，反应终止后，将样本取出，-80℃冰箱内保存备用。采用2-ΔΔCt法分析计算[8]。

1.2.3 MTT 法检测细……