方首镕 王晓云 蒋宁宁 孙立平

口腔鳞状细胞癌简称口腔鳞癌，是常见的头颈部恶性肿瘤之一，癌细胞的增殖活力强、恶性程度高，治疗后的复发率、转移率均较高，5 年生存率不足50%[1，2]。目前，口腔鳞癌的发病机制未阐明，临床上也缺乏靶向治疗口腔鳞癌的手段。因此，研究口腔鳞癌的发病机制、寻找靶向癌细胞增殖的精确治疗靶点具有十分重要意义。

微小RNA(microRNA，miR)是近年来发现的具有广泛生物学作用的非编码小分子RNA，多种miR 在恶性肿瘤发生发展的过程中通过靶向调节细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭来起到促癌或抑癌作用。miR-375 是一种具有抑癌作用的miR，在前列腺癌、食管癌、直肠癌、口腔鳞癌中的表达均明显减少[3-6]，提示增加miR-375 表达可能是潜在的抗癌靶点。前列腺癌相关的细胞实验证实，miR-375 对细胞周期蛋白D2(cyclinD2)的表达具有抑制作用[7]；在targetscan 网站进行生物信息学分析可知，cyclinD2 基因mRNA 的3’非翻译区(3’UTR)中有miR-375 的结合靶点。基于此提出假设：miR-375能够在口腔鳞癌中靶向cyclinD2 并调节细胞的恶性生物学特征。为了验证这一假设，本实验以口腔鳞癌细胞株CAL27 为实验对象，具体分析了miR-375 靶向cyclin D2 调节细胞增殖及凋亡的作用。

1.材料与方法

1.1 细胞 口腔鳞癌细胞株CAL27(ATCC 公司，美国)，液氮中冷冻保存。

1.2 试剂 阴性对照(NC)mimic、miR-375 mimic、NC siRNA、cyclinD2 siRNA(上海吉玛公司，中国)，表达cyclinD2 的pcDNA3.1 质粒及空白的pcDNA3.1 质粒(上海生工公司，中国)，miRNA 专用的提取分离试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒(北京天根公司，中国)，MTS 细胞增殖活力检测试剂盒及Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(北京全式金公司，中国)，cyclinD2 的单克隆一抗(Abcam 公司，美国)。

1.3 仪器 细胞培养箱(Thermo 公司，美国)，凝胶成像仪及荧光定量PCR 仪(Bio-rad 公司，美国)，显微镜(Olympus 公司，日本)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及分组干预 CAL27 在含有10%胎牛血清的DMEM 中培养，0.25%的胰蛋白酶消化细胞并传代，取传代后对数生长期的细胞进行分组，方法如下：(1)对照组用不含脂质体的DMEM干预；(2)NC mimic 组用脂质体转染NC mimic；(3)miR-375 mimic 组用脂质体转染miR-375 mimic；(4)NC siRNA 组用脂质体转染NC siRNA；(5)cyclinD2 用脂质体转染cyclinD2 siRNA；(6)空白质粒+miR-375 mimic 组用脂质体转染空白的pcDNA3.1 质粒及miR-375 mimic；(7)cyclinD2 质粒+miR-375 mimic 组用脂质体转染表达cyclinD的pcDNA3.1 质粒及miR-375 mimic。每组设置5 个复孔，连续干预24 小时。

1.4.2 细胞增殖活力的检测 传代的CAL27细胞调节至细胞密度为3×104/ mL，按照每孔200μL 接种在96 孔培养板内并按1.4.1 的方法进行分组干预，24 小时后按照MTS 细胞增殖活力检测试剂盒的说明书进行操作，检测细胞在490nm波长处的细胞中，记录为OD490，OD490 越高、细胞增殖活力越强。

1.4.3 细胞凋亡的检测 传代的CAL27 细胞调节至细胞密度为3×104/ mL，按照每孔500μL接种在24 孔培养板内并按1.4.1 的方法进行分组干预，24 小时后消化收集细胞，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行染色操作，染色后在流式细胞仪上计计算Annexin V 阳性且FITC阴性的细胞比例，即为凋亡率。

1.4.4 miR-375 表达的检测 传代的CAL27细胞接种在12 孔培养板内并按1.4.1 的方法进行分组干预，24 小时后弃去培养基、保留细胞，采用miRNA 专用的提取试剂盒提取细胞中的miRNA，采用cDNA 第一链合成试剂盒将细胞中的miRNA反转录为cDNA，用荧光定量PCR 检测试剂盒对cDNA 中的miR-375 及U6 进行扩增，软件中自动生成循环曲线及循环阈值(Ct)，根据Ct 计算miR-375 的表达水平。

1.4.5 cyclinD2 表达的检测 传代的CAL27细胞调节至细胞密度为3×104/ mL，按照每孔1.0mL 接种在12 孔培养板内并按1.4.1 的方法进行分组干预，24 小时后弃去培养基、保留细胞，用RIPA 裂解液提取细胞中的蛋白，用BCA 试剂盒测定蛋白含量，取含有30μg 蛋白的样本进行western blot，将样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳后电转膜NC 后，将NC 膜放入5%脱脂牛奶中、室温封闭1 小时，而后将NC 膜放入1∶1000 稀释的cyclinD2 一抗或1∶5000 稀释的β-actin 一抗中、4℃孵育过夜；第二天，将NC 膜放入1∶2000稀释的HRP 二抗中、室温孵育1 小时，最后在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，根据条带的灰度值、以β-actin 为内参计算cyclinD2 的表达水平。

1.2.6 miR-375 靶向cyclinD2 的生物信息学分析 在targetscan 数据库中进行生物信息学分析，输入miR-375 后得到靶基因列表，分析cyclinD2 基因mRNA 3’UTR 中与miR-375 结合的位点及碱基。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测 构建包含cyclinD2 基因mRNA 3’UTR 的双荧光素酶报告基因，先将双荧光素酶报告基因用脂质体转染进入细胞，而后按照NC mimic 组和miR-375 mimic组的干预方法分别用脂质体转染NC mimic 或miR-375 mimic，24 小时后收集细胞并用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定萤火虫荧光值和海肾荧光值，计算萤火虫荧光值/ 海肾荧光值，以此反映双荧光素酶报告基因的荧光活性。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS23.0 软件录入数据，三组间计量资料的比较采用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 过表达miR-375 对CAL27 细胞增殖及凋亡的影响 与对照组、NC mimic 组比较，miR-375 mimic 组细胞中miR-375 的表达水平及凋亡率均明显增加，增殖活力OD490 水平明显降低(P＜0.05)，见图1。

2.2 过表达miR-375 对CAL27 细胞中cyclin D2 的靶向调节 经Targetscan 进行生物信息学预测，miR-375 能够靶向cyclinD2 mRNA 3’UTR；与对照组、NC mimic 组比较，miR-375 mimic 组细胞中cyclinD2 的表达水平、荧光素酶报告基因的荧光活力明显降低(P＜0.05)，见图2。

图1 三组间miR-375 表达、OD490 水平、凋亡率的比较

图2 三组间cyclin D2 表达、荧光素酶报告基因活力的比较

2.3 敲低cyclinD2 对CAL27 细胞增殖及凋亡的影响 与对照组及NC siRNA 组比较，cyclinD2 siRNA 组细胞中cyclinD2 的表达水平及增殖活力OD490 水平明显降低，凋亡率均明显增加(P＜0.05)，见图3。

2.4 过表达cyclinD2 对miR-375 调节CAL27细胞增殖及凋亡的影响 与空白质粒组比较，空白质粒+miR-375 mimic 组细胞中cyclinD2 的表达水平及增殖活力OD490 水平明显降低，凋亡率均明显增加(P＜0.05)，见图4。

3.讨论

癌细胞增殖及凋亡异常是口腔鳞癌重要的恶性生物学特征，研究口腔鳞癌细胞增殖及凋亡的调控机制有助于深入认识口腔鳞癌的发病机制。近年来，多种miR 被证实在恶性肿瘤的发生发展过程中起到促癌或抑癌作用，相应的在恶性肿瘤病灶中发生了高表达或低表达。miR-375 是在多种恶性肿瘤病灶中表达减少的一种具有抑癌作用的miR，多项细胞实验证实，miR-375 对结直肠癌、胶质瘤、胃癌等恶性肿瘤细胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促进作用[8-10]。在口腔鳞癌患者的唾液中，miR-375 的表达明显降低[6]，但miR-375 对口腔鳞癌细胞增殖及凋亡的调控作用及机制仍未阐明。因此，本实验将以口腔鳞癌细胞CAL27 为对象、通过分析miR-375 对癌细胞增殖及凋亡的调控作用及机制来阐明miR-375 在口腔鳞癌发生发展中所起的作用。

图3 三组间cyclinD2 表达、OD490 水平、凋亡率的比较

图4 三组间cyclinD2 表达、OD490 水平、凋亡率的比较

在本实验中，将miR-375 mimic 转染进入CAL27 细胞后、细胞中miR-375 的表达明显增多；在过表达miR-375 后，CAL27 细胞的增殖活力下降、凋亡率增加，说明miR-375 对CAL27 的增殖具有抑制作用、凋亡具有促进作用，这一生物学作用与miR-375 在口腔鳞癌患者唾液中表达降低的现象吻合。MiR 生物学作用的实现依赖与靶向结合靶基因mRNA 的3’UTR 后对基因表达的抑制，本实验在targetscan 网站中对miR-375 进行了生物信息学分析并发现促增殖基因cyclinD2的3’UTR 上有miR-375 的结合靶点，转染miR-375 mimic 后，CAL27 细胞中cyclinD2 的表达减少、含有CAL27 细胞基因3’UTR 的双荧光素酶报告基因的荧光值明显下降，说明cyclinD2 是miR-375 的靶基因，miR-375 靶向抑制cyclinD2的表达与其抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用有关。

CyclinD2 是调控细胞周期进程的蛋白，与细胞周期蛋白激酶形成复合体后能够加速细胞周期，进而使细胞增殖活力增强、细胞凋亡受阻。多种因子被证实能够通过改变cyclinD2 的表达来调节口腔鳞癌细胞的增殖及凋亡[11，12]。本实验的结果已经证实miR-375 能够靶向抑制cyclinD2 的表达，进一步通过转染cyclinD2 siRNA 的方式来敲低cyclinD2 的表达并验证CAL27 细胞中cyclinD2 表达下调的生物学效应。在敲低cyclinD2 的表达后，CAL27 细胞的增殖活力减弱、凋亡率增加，说明miR-375 引起的cyclinD2 表达减弱具有抑制增殖、促进凋亡的效应。为了进一步验证miR-375 通过靶向cyclinD2 来调节CAL27 细胞的增殖和凋亡，本实验还设计了过表达cyclinD2 的质粒，转染质粒使细胞中的cyclinD2 发生过表达后，miR-375 抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用发生了逆转，说明cyclinD2 表达减少介导了miR-375 抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。

综上所述，miR-375 对口腔鳞癌细胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促进作用且靶向抑制cyclinD2 是介导该作用的分子机制之一，未来miR-375 可以作为治疗口腔鳞癌的靶点，但miR-375对口腔鳞癌的治疗价值仍需进一步深入的研究。