杨娟，钟昕，朱世真，杨晓云

（青岛市食品药品检验研究院，山东青岛 266071）

微生物检验是依法设置的各级食品药品检验机构检验工作中的重要一环，主要检验产品涉及药品、食品、化妆品等。微生物存在于检验样品中，一般以单个菌体形式或集团菌体形式存在。被微生物污染的药品不仅会影响治疗效果，还会进一步加重患者病情[1]。食品微生物污染事件时有发生，被污染的食物一经食用，会对人们的生命健康造成极其不利的影响。化妆品中的微生物指标直接影响化妆品的质量。检验工作中的微生物检验十分重要，但微生物检验过程复杂，影响其检验质量的因素较多。在检测过程中，样品中微生物受到培养基质量、操作环境、稀释溶液、培养温度、观察结果时间和操作人员技能等因素的影响，导致检验结果的离散度较大[2]。因此，测量不确定度的评定是确保微生物检验质量和提高微生物检验水平的重要抓手，在质量控制中必不可少。只有确定检验样品微生物符合限定标准，才能将产品投入市场，最大程度地降低使用风险，保障消费者的身体健康。

《测量不确定度评定和表示指南》给出的测量不确定度的定义是：与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散程度。测量不确定度越小，说明检测水平越高，检测结果的使用价值越大[3]。各级食品药品检验机构对外出具的检验检测数据是判定检品质量的重要依据，特别是当检验检测数据处于标准规定的边缘时，引入不确定度参数对评估定量分析方法的可靠性和测量结果的准确性就更加重要[4]。在实验室认可和资质认定的实践过程中，测量不确定度在检测数据质量的提高、测量结果临界值的判断、方法确认以及实验室质量控制、实验室风险控制方面具有重要意义。

随着微生物检验领域的发展，检测手段和检验方法逐步完善。作为一种科学、合理的验证手段及质量控制方法，测量不确定度正越来越多地被引入。故此，针对微生物检验的不同领域（药品、食品、化妆品）的测量不确定度的国内最新研究进展进行了综述，并就其应用加以探讨。

1 药品微生物检验

药品是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药、化学药和生物制品等。药品微生物检验作为药品检验的一大类分支，己经越来越多地运用到了各个药品品种中。药品微生物检验是保证药品质量的重要手段，只有切实提高对药品微生物检验工作的重视，才能最大程度上保证药品投入市场后的疗效。2020 年版《中国药典》对药品微生物检验的质量控制提出了更为严格的要求。由于微生物检验的特殊性及难以定量的特性，测量不确定度在该领域的运用一直进展缓慢，相关的文献报道也较少，但在微生物效价方面由于效价方法比较成熟，测量不确定度在该领域有所建树。

1.1 化学药品

董超琪等[4]对微生物检定法测定庆大霉素注射液含量的测量不确定度进行评定分析，计算出扩展不确定度U=3.88%（k=2），庆大霉素注射液含量测定结果可表示为99.94%±3.88%。测量不确定度主要是来源于高低剂量抑菌圈直径值、抑菌圈测量仪、实验设计的不确定度、标准品称量、标准品纯度、标准品溶液稀释、供试品量取及稀释、样品估计效价。邢以文等[5]以统计学为工具建立硫酸庆大霉素片含量测定的测量不确定度评估方法。计算出扩展不确定度U=3.2%（k=2），硫酸庆大霉素片含量测定结果可表示为98.6%±3.2%。钱桂英等[6]采用微生物检定法测定庆大霉素普鲁卡因胶囊中庆大霉素含量的不确定度以提高测定结果的准确性和可靠性。量化了各分量的相对标准不确定度，并计算出总合成标准不确定度，得出扩展不确定度为U=2.98%（k=2），庆大霉素的含量测定结果可表示为88.41%±2.98%。测量不确定度主要来源为试验设计、抑菌圈直径和供试品平均装量等。宋玉霞等[7]对微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片含量的不确定度进行评定。采用二剂量法，计算扩展不确定度U=6.0%（k=2），乙酰螺旋霉素含量测定结果可表示为98.4%±6.0%。安贤兰等[8]探讨注射用磷霉素钠含量采用抗生素微生物检定法鉴定的不确定度评定方法，计算扩展不确定度为U=4.9%（k=2），注射用磷霉素钠含量测定结果可表示为100.5%±4.9%。于丽娜等[9]为研究微生物检定法测定硫酸卡那霉素注射液生物效价试验中各因素对结果的影响，采用不确定度分析，将影响因素归纳为称量、稀释、加样、测定、平行试验，量化各不确定度分量，评估各因素的影响因子。结果表明，牛津杯加样体积对测定结果影响最大，提示试验中应尽可能精确控制加样体积。白青山等[10]评定以微生物检定法测定红霉素原料含量的不确定度。测量不确定度主要来源为方法设计，其次为溶液稀释。选择适宜的方法设计，尽可能减少稀释次数，可有效减小试验的不确定度。

微生物检定法测定药品中有效成分含量的测量不确定度分析，方法清晰合理、简便准确，适合微生物检定法的不确定度评定。在对测量不确定度进行分析与评估时，应尽可能地对测量不确定度的所有来源进行密切考察，防止出现遗漏。微生物检定法测量不确定度的来源较多，包括抑制圈的控制、抑制圈边缘清晰度以及细菌生长情况、高低剂量抑菌圈直径值、抑菌圈测量仪、实验设计的不确定度、标准品称量、标准品纯度、标准品溶液稀释、供试品量取及稀释、样品估计等。药品微生物检验要求检验人员一方面要熟练掌握微生物知识，另一方面需要掌握化学药品的性质，才能够将测量不确定度不断降低，从而得出精确且可靠的结果。

1.2 中成药及中药制剂

舒玉萍等[11]对中药制剂补中益气丸微生物检验的不确定度分析，计算扩展不确定度为U=7.3%（k=2）。与一般的测量相比较，补中益气丸的菌落总数测定的特点是测量结果的发散性较大，测量不确定度的评定有助于减少测量结果的误差。吕婷婷等[12]建立板蓝根颗粒霉菌和酵母菌总数不确定度评定方法，计算扩展不确定度为U=15.2%（k=2）。测量结果的不确定度主要来源于不同人员的重复性操作。王娟等[13]建立荆防颗粒需氧菌总数不确定度评定方法，对需氧菌总数进行不确定度评定，并计算扩展不确定度为U=8.8%（k=2）。建立的不确定评定方法简单方便，可新增加检验样本结果，通过重新计算合并样本标准差，得到新的不确定度取值范围。

分析中成药及中药制剂微生物检验的测量不确定度主要来源于不同人员的重复性操作、操作环境、培养基、仪器设备、菌落计数、药品性质等因素的影响，导致检查结果出现偏差不能准确判断。结果的测量不确定度主要是由多种因素联合作用导致，单一因素影响较低[14]。中成药及中药制剂微生物检验操作烦琐，对环境和人员要求严格，检验人员应进行岗前培训并通过考核，以确保检查结果的准确性、科学性。

2 食品微生物检验

2.1 一般食品

食品是指各种供人食用或者饮用的成品和原料以及按照传统既是食品又是药品的物品，但是不包括以治疗为目的的物品。食品安全和人们的身体健康具有极为密切的联系，是目前我国比较关注的问题。在进行食品检验时，微生物检验是极为重要的一环，不但能够检验食品的具体情况，其检验成果也比其他检验环节更加准确[15]。菌落总数是食品微生物检验的重要卫生指标之一，因此对菌落总数检测结果进行测量不确定度的评定是很有必要的。

徐腾月等[16]对食品微生物检验进行了测量不确定度评定，以压缩干粮为例对菌落总数进行了不确定度评定，探讨了其对生产过程的指导。测量不确定度来源主要是样品的重复测量、称量过程、稀释过程及菌落计数过程。其中重复测量带来的不确定度占主要部分。菌落总数测量不确定度评定可使检验结果更加接近真实值，可用于评价实验室的检验能力，且提高了判定产品合格与否的准确率。曹艳娟等[17]评定微生物法测定全营养配方食品中生物素的不确定度。计算扩展不确定度为U=1.8%（k=2）。测量不确定度来源主要为测量重复性、标准物质称量、标准溶液配制过程，次要来源是试样系列管制备过程、标准曲线拟合、紫外分光光度计的偏差和样液制备过程。毛永杨等[18]对米线中菌落总数测定结果的不确定度进行评估，计算扩展不确定度为U=4.9%（k=2）。影响结果不确定度的主要因素为样品的均匀性和重复测定，该评估系统可为今后实验室测定食品中菌落总数的不确定度评估提供参考，为检验检测结果的科学表达提供依据。赵丽等[19]对糕点中菌落总数的测量结果进行不确定度评定，计算扩展不确定度为U=2.2%（k=2）。糕点菌落总数检验中重复性检验和培养基的菌落生长率对测量不确定度影响最大，需要在检测过程中注意。

分析食品微生物检验的测量不确定度主要来源于样品的重复测量、称量过程、菌落计数过程、标准溶液配制过程、试样系列管制备过程、标准曲线拟合、样液制备过程等因素的影响，导致检查结果出现偏差不能准确判断。各级食品药品检验机构在实施食品微生物检验的过程中，应做好对检验设备、实验室内外部环境的管理。工作人员要按照相应的规章制度进行检验，根据检验标准对检验过程化质量控制。通过对食品微生物检验进行测量不确定度评定，让食品检验结果更加可信，提高食品检验的质量，从而保证食品安全。

2.2 保健食品

保健食品是指具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品，即适宜于特定人群食用、具有调节机体功能、不以治疗疾病为目并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害的食品[20]。保健食品的保健作用在当今的社会中，也正在逐步被广大群众所接受。对保健食品的微生物检验进行测量不确定度评定，可以使检验结果更加准确可信。

郑东宇等[21]对不同性状的保健品在微生物定量检验过程中的主要量值进行不确定度评定分析。使用大肠埃希氏标准菌株制备人工染菌测试液，对胶囊样品、片剂样品与液体样品保健品进行菌落总数定量检测。胶囊样品扩展不确定度为U=4.1%（k=2），片剂样品扩展不确定度为U=7.7%（k=2），液体样品扩展不确定度为U=3.6%（k=2）。测量不确定度主要来源为实验室内再现性标准偏差，次要来源为样品制备和样品加样过程。微生物检验实验室在进行不确定度评定时应充分考虑样品基质对再现性标准偏差的影响，按照样品类别区分进行测量不确定度评定。

2.3 饮用水

饮用水属于食品范畴，但是又是特殊的存在，因为饮用水关乎民生，其中微生物的指标又直接反映饮用水的污染程度。但微生物检验过程复杂，影响其检验质量的因素较多[22]。对饮用水微生物检验进行测量不确定度评定能最大可能地避免实验误差，减少环境影响，确保检测结果的准确性，更好地为饮用水检验服务。

王利艳[23]通过不确定度评定对饮用纯净水中菌落总数测量结果临界值进行判断，扩展不确定度为U=14.4%（k=2）。样品平行测试结果取对数值用于菌落总数不确定度的评定，可以用来对检测结果处于超标临界值的合理判定。龚剑等[24]评定了微生物电极法测定地表水中生化需氧量的测量不确定度。扩展不确定度U=1.7%（k=2）。测量不确定度主要来自仪器分析的重复性。李英杰[25]评估水源水中菌落总数检测结果的不确定度，计算扩展不确定度为U=6.2%（k=2），样品测量结果均在其各自的置信区间范围内。研究建立的方法同样适合类似检测条件下菌落总数不确定的评定。丁珵等[26]评定生活饮用水及其水源水中菌落总数测定的不确定度。生活饮用水中菌落总数的扩展不确定度为U=4.7%（k=2），水源水中菌落总数的扩展不确定度为U=2.4%（k=2），适用于菌落总数不确定度的评定。利用指数法可以对菌落总数的不确定度进行合理判定。

饮用水是否安全对于人们的身体健康有很大的影响。检验机构根据不同微生物的特点，合理运用不同的微生物检验技术，对水质进行相关检验，通过测量不确定度的评定能够有效减小检验结果的误差。

3 化妆品微生物检验

微生物检验是化妆品进入市场中的一个重要环节，人们在购买化妆品时也越来越关注微生物检验情况，微生物对化妆品的影响应引起相关检验机构的足够重视[27]。各级食品药品检验机构也承担着化妆品检验职责，在化妆品检验过程中更应注重微生物检验。从现状来看，我国化妆品微生物检验起步较晚，检测技术还不够先进，微生物检验过程中也存在判断失误的情况，而化妆品微生物检验与药品微生物检验，二者在检验标准、实验室环境、培养基、样品采集、方法验证和菌落报告方式等方面都存在不同[28]，所以化妆品微生物检验的测量不确定度评价尤为重要。

郑萍等[29-30]评定化妆品中霉菌和酵母菌检测结果的测量不确定度，计算扩展不确定度为U=6.9%（k=2）。评定化妆品中菌落总数指标检测的测量不确定度，计算扩展不确定度为U=3.8%（k=2）。化妆品霉菌、酵母菌总数、菌落总数的测量不确定度的主要来源均为重复测定。吴卫玲等[31]对乳液中霉菌和酵母菌总数进行检测，检测结果进行不确定度的评定。扩展不确定度为U=7.0%（k=2），建立的不确定度评定方法可适用于化妆品的合格性判断。杨兰花等[32]为减少实验计算误差，对一种化妆品微生物菌落总数进行不确定度的评定。对同一样品由同一操作人员采用同一方法重复测试，用两种不同的评定方法，分别取平均值以及对数平均值作为测试结果，表明菌落总数检测结果分散性较大时宜采用对数平均值作为测试结果进行评定。化妆品微生物检验的测量不确定度的来源主要包括样品的均匀性、取样的重复性、人员的操作技术、人员的计数与修约等。

4 结语

在我国根据法律法规及标准要求进行微生物检验具有非常重要的现实意义，而测量不确定度经过多年的发展，其计算方法己经日趋完善，在微生物检验方面应用前景非常广阔，对于提高微生物检验结果的准确性有着积极意义。测量不确定度在微生物检验方面的应用将在检验数据的统计处理、方法学验证、限度制订、质量标准起草方面发挥巨大的作用。