兰玉菲，张焕利，于清伟，丛倩倩

（泰安市农业科学研究院，山东 泰安 271000）

金针菇[Flammulina velutipes（Fr.）Singer]，是一种在世界上广泛栽培的重要食用菌之一，营养丰富、味道鲜美，深受人们喜爱[1-2]。

近几年，山东省工厂化金针菇发展迅速，主要栽培种类为白色金针菇。随着栽培规模的不断扩大和栽培年限的延长，病害发生越发严重，黑腐病是金针菇工厂化生产中的主要病害之一，给工厂化金针菇生产带了严重损失。为明确黑腐病病原菌，对病原菌进行分离和分子鉴定，明确了病原菌的分类地位，为科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.2 培养基

NA 培养基：蛋白胨 10 g·L-1、牛肉膏 3 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、琼脂 20 g·L-1。

LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1。

1.3 病原菌分离和纯化

分别取菌盖和菌柄病健交界处组织进行病原菌的分离、纯化，方法参照文献[3]。

1.4 致病性测定

将纯化的菌株在NA平板上28℃培养48 h后，用无菌水配成细菌悬浮液（约1×108cfu·mL-1）。采用喷雾法接种，分别将2 mL细菌悬浮液喷洒在正常生长的金针菇菌盖和菌柄处，无菌水处理为对照，接种后的金针菇置于15℃菇房内，保持空气相对湿度90%，每天观察发病情况。从接种发病的金针菇菌盖和菌柄上重新分离病原菌并鉴定。

1.5 病原菌的分子鉴定

1.5.1 基因组DNA提取

将分离纯化的菌株在NA培养基上划线，挑取单菌落于LB培养基中，28℃震荡培养过夜，收集菌体，利用Solarbio细菌基因组DNA提取试剂盒提取致病菌基因组DNA。

1.5.2 16S rDNA和gyrB序列的扩增

以DNA为模板，使用高保真酶，利用引物分别扩增致病菌的16S rDNA和gyrB序列，引物名称及序列见表1。……