张存艳，魏蔼玲，岳茂林，叶强，郭力，李美凤

成都中医药大学药学院西南道地药材协同创新中心中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室（成都 611137）

松露，又称“块菌”，是一种子囊菌类大型块状真菌[1]，其香味独特、营养丰富，蛋白质含量普遍比较高，具有保健功能和药用价值[2]。松露中的多糖类是被研究较多的生物活性物质，多糖的提取率在20%左右，抗氧化活性较好[3-5]，但由于鲜松露含水量高达75.21%～79.39%[6]，在常温下贮藏易腐烂变质，影响其商品价值，而其干制品不但利于保存，且保留了特殊的香味。干松露包装后保质期可以延长至1年以上，大大增加了松露的商业价值。目前已有的关于松露的研究报道大多是关于某个营养成分的综合性研究，但关于不同干燥方式对松露多糖含量及抗氧化活性的影响研究则比较少。故此次试验考察热风干燥、微波干燥、冷冻干燥和真空冷冻干燥4种不同的干燥方式对松露多糖含量及其抗氧化活性的影响。筛选出最适合松露的干燥方法，旨在为松露干燥方式提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

电子天平（BSA224S-CW，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；电热恒温真空干燥箱（DZF-OB，上海跃进医疗器械有限公司冷冻干燥机）；旋片式真空泵（2XZ-2B，临海市永昊真空设备有限公司）；微波干燥箱（RWBZ-08S，南京苏恩瑞干燥设备有限公司）；超声清洗器（SB-5200DTDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-6，常州澳华仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（GZIGF10，上海跃进医疗器械有限公司）；L2S可见光分光光度计（756PC，上海仪电分析仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE 52-99，上海亚荣生化仪器厂）；循环水式真空泵（SHZ-D（Ⅲ），巩义市予华仪器有限责任公司）；密封型摇摆式粉碎机（HK-10B；上海菲恰尔分析仪器有限公司）；离心机（TDL-6A，上海菲恰尔分析仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

新鲜松露，四川省凉山州会东县农贸市场。

葡萄糖对照品、抗坏血酸对照品，成都曼思特生物科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2, 2’-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（2, 2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS），东京化成工业株式会社；盐酸、硫酸、苯酚、无水乙醇、过硫酸钾、氯仿、正丁醇，成都市科龙化工试剂厂，所用试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 干燥工艺

1.3.1.1 鲜松露预处理

取鲜松露，洗去表面泥土，避免其表面出现损伤；待表面水分挥发后，挑选大小相近的松露，切成厚度约为0.5 cm的薄片，分成4份，供下一步处理。

1.3.1.2 真空干燥

使用真空干燥设备，干燥条件：真空度0.2 kPa，干燥温度50 ℃，以松露含水率13%（湿基）为干燥终点，记录干燥时间。

1.3.1.3 热风干燥

使用电热鼓风干燥箱设备，干燥条件：干燥温度50 ℃，干燥风速3 m/s，以松露含水率13%为干燥终点，记录干燥时间。

1.3.1.4 真空冷冻干燥

使用真空冷冻干燥设备，干燥条件：温度-50℃，真空度0.2 kPa，以松露含水率13%为干燥终点，记录干燥时间。

1.3.1.5 微波干燥

使用真空微波干燥设备，干燥条件：干燥温度50℃，功率400 W，真空度0.2 kPa，以松露含水率13%为干燥终点，记录干燥时间。

以上干燥完成后，需将松露密封保存于干燥器中，避免吸潮。

1.3.2 多糖提取及纯化

1.3.2.1 多糖提取

采用超声辅助法提取多糖[7-8]。将干燥后的松露粉碎，过40目筛，分别取5.0 g各干燥品粉末，置于250 mL容量瓶，以料液比1∶25（g/mL）加入蒸馏水，超声处理50 min（140 W，60 ℃），离心10 min（4 500 r/min），取上清，下层沉淀重复以上操作。合并2次上清液，浓缩至50 mL。

1.3.2.2 多糖的纯化

脱蛋白：采用Sevag法进行脱蛋白处理[9]。取适量样品溶液，加入20%体积的Sevag试剂，振荡后静置20 min，离心（5 000 r/min，10 min），收集上清液，弃去中间的蛋白层和下层的有机层，重复上述操作直至无沉淀物析出。

醇沉：向脱蛋白的提取液中加入3倍体积的95%乙醇，边加边振摇，于4 ℃冰箱静置过夜；离心15 min（4 500 r/min，4 ℃），收集沉淀。

透析：将上述沉淀溶解于适量体积的蒸馏水，置于分子量截留量为12 000 Da的透析袋中，超纯水透析3d，以除去小分子物质。

冷冻干燥：将透析后的溶液离心10 min（4 000 r/min），收集沉淀，于-20 ℃冰箱预冻24 h，转移至真空冷冻干燥箱，24 h后取出，称质量，多糖提取率按式（1）计算。

式中：m1为称量瓶质量，g；m2为称量瓶及多糖质量，g；m3为松露质量，g。

1.3.3 多糖含量测定

1.3.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚-硫酸法[10]。准确称取10 mg葡萄糖标准品，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即得质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL葡萄糖标准溶液于具塞试管中，加蒸馏水补至1.0 mL，再加入1.0 mL 5%的苯酚，迅速加入5.0 mL浓硫酸，涡旋混匀后，冷却至室温，在490 nm处测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=10.05x+0.001 8，R2=0.999 6。

1.3.3.2 多糖含量的测定

称取25 mg冷冻干燥后的松露多糖，置于25 mL容量瓶，蒸馏水定容。吸取1 mL配制的多糖溶液于具塞试管中，按1.3.3.1小节的方法测定样品中多糖含量，每组样品重复测定3次，根据标准曲线计算样品多糖含量。

1.3.4 多糖抗氧化活性的测定

1.3.4.1 DPPH·清除率的测定

参照文献方法[11]。准确称取15.77 mg DPPH，置于100 mL容量瓶，用无水乙醇溶解并定容，即得0.4 mmol/L的DPPH乙醇溶液（现配现用），保存于棕色试剂瓶中，备用。准确称取0.1 g松露多糖，用蒸馏水溶解并定容到25 mL，配制不同质量浓度的（0，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000，3.000和4.000 mg/mL）的多糖样品；分别吸取3 mL上述样品溶液于试管中，加入2 mL DPPH溶液，混匀后，避光静置反应30 min，在517 nm处测定吸光度A1。同时将3 mL不同浓度的样品溶液与无水乙醇混匀反应，测定其吸光度A2，测定空白溶剂（3 mL蒸馏水与2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液的混合溶液）在517 nm处的吸光度A0，以同等浓度的抗坏血酸溶液为阳性对照。每组做3个平行，结果取均值。DPPH·清除活力按式（2）计算。

1.3.4.2 ABTS+·清除率的测定

参照文献[12]方法。ABTS储备液的配制：将5 mL 7 mmol/L ABTS+·溶液和1 mL 15 mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下反应12 h，得到ABTS储备液。取一定量的ABTS储备液，用蒸馏水稀释一定倍数后，在734 nm波长处测定吸光度A0（现配现用）。取4 mL ABTS工作液，分别与0.2 mL上述不同质量浓度的松露多糖溶液混合，室温下反应6 min，在734 nm波长处测定吸光度A1；以同等浓度的抗坏血酸作阳性对照。每组做3个平行，结果取均值。ABTS+·清除率按式（3）计算。

1.4 数据处理与统计分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据方差分析，结果以平均值±标准差表示，并用Duncan’s法进行多重比较，Pearson’s法进行相关性分析。以p＜0.05表示差异或相关性显著，以p＜0.01表示差异或相关性极显著。

2 结果与分析

2.1 干燥方式对松露多糖含量的影响

2.1.1 多糖提取率

4种干燥方式对松露多糖提取率的影响及以含水率低于13%为干燥终点时所用的时间结果如表1所示。真空冷冻干燥后松露多糖提取率为7.56%±0.37%，显著高于微波干燥（6.60%±0.43%）、热风干燥（6.30%±0.17%）、真空干燥（5.12%±0.26%）（p＜0.05）；热风干燥与微波干燥对松露多糖提取率无显著性影响（p＞0.05）；真空干燥松露多糖的提取率最低，说明不同干燥方式会造成松露多糖不同程度的损失。不同干燥方式所需的干燥时间为真空干燥（10 h）＞热风干燥（8 h）＞微波干燥（7 h）＞真空冷冻干燥（4 h），多糖提取率与干燥时间存在着负相关性（p＜0.05），即干燥时间越长，松露多糖的提取率越低，说明随着干燥时间的延长，松露多糖降解得越多。

表1 干燥方式对松露多糖提取率、干燥时间及多糖含量的影响

2.1.2 多糖含量

如表1 所示，经不同方式干燥处理，松露多糖含量由高到低依次为真空冷冻干燥（34.40%±0.26%）、热风干燥（31.40%±0.26%）、真空干燥（28.50%±0.53%）、微波干燥（28.30%±0.57%），真空冷冻干燥后松露多糖含量明显高于热风干燥、真空干燥、微波干燥（p＞0.05），真空干燥和微波干燥对松露多糖含量无显著影响（p＞0.05），说明真空冷冻干燥对松露多糖的含量影响最小。

2.2 干燥方式对松露多糖抗氧化活性的影响

2.2.1 松露多糖对DPPH·的清除能力

由图1可知，经4种干燥方式处理的松露多糖提取物对DPPH·均有较好的清除效果，且效果随着其质量浓度的增加而逐渐增强，但均比对照品VC的作用弱。当多糖质量浓度为4 mg/mL时，真空冷冻干燥所得松露多糖提取物对DPPH·清除活力达到了65.18%，作用明显强于微波干燥、热风干燥、真空干燥的松露多糖提取物（p＜0.05）。松露多糖提取物对DPPH·的清除率可用DPPH·清除率达到50%时多糖的质量浓度即IC50来表示，IC50值越小说明该多糖清除DPPH·的能力越强。经真空冷冻干燥、微波干燥、热风干燥、真空干燥，松露多糖提取物的DPPH·清除率IC50值分别是1.816，2.554，3.959和2.860 mg/mL，即松露多糖提取物对DPPH·的清除率为真空冷冻干燥＞微波干燥＞真空干燥＞热风干燥。结果表明松露经真空冷冻干燥处理，可以更好地保留松露多糖的抗氧化活性。

图1 4种干燥方式对DPPH·清除活力的影响

2.2.2 松露多糖对ABTS+·的清除能力

由图2可知，4种干燥方式处理的松露多糖对ABTS+·均有较强的清除作用，且随着样品质量浓度的增加而增强，但均比对照品VC的作用弱当质量浓度为1.25 mg/mL时，其对ABTS+·清除活力由高到低分别为真空冷冻干燥（65.7%）＞微波干燥（53.09%）＞真空干燥（51.78%）＞热风干燥（44.78%）；其对ABTS+·清除率IC50值由小到大为真空冷冻干燥（0.91）＜微波干燥（1.062）＜真空干燥（1.138）＜热风干燥（1.246），说明真空冷冻干燥松露多糖提取物对ABTS+·的清除活力最强，热风干燥作用最弱。

综上，不同干燥方式处理的松露多糖提取物对DPPH·、ABTS+·清除活力趋势一致。当质量浓度为1.00 mg/mL时，松露多糖提取物对DPPH·的清除能力大小为真空冷冻干燥（40.22%）＞微波干燥（37.59%）＞真空干燥（37.48%）＞热风干燥（28.28%）；其对ABTS+·的清除能力大小为真空冷冻干燥（54.03%）＞微波干燥（47.88%）＞真空干燥（40.52%）＞热风干燥（36.86%），说明松露多糖提取物对ABTS+·的清除效果优于相同质量浓度下对DPPH·的清除效果。

3 讨论与结论

3.1 讨论

结果显示，真空冷冻干燥松露多糖提取率最高，这与真空冷冻干燥技术的特点有关[13]，其特点为低温脱水，使松露本身的物理、化学和生物状态基本不变，从而使松露本身的营养物质和有效成分得到最大保留。而微波干燥、热风干燥、真空干燥都是通过高温加热来达到干燥的目的，虽然都具有干燥速度快、效率高等特点[14]，但是在干燥过程中其对具有挥发性成分和热敏性物质具有较大的破坏作用，从而使多糖含量不同程度的降低。

松露中的多糖类是研究较多的生物活性物质，松露多糖普遍具有显著的抗氧化活性[15]，多糖纯化程度越高，抗氧化能力越强。在对国产松露的子实体提取物进行抗氧化研究时，发现松露的乙醇提取物有很高的DPPH·清除活性，乙酸乙酯提取物对羟自由基及铁离子表现出较强的清除能力或螯合能力，但是石油醚提取物的清除自由基和铁离子鳌合能力较差[16]，说明松露中能清除自由基的活性物质是极性较大的组分，主要提取到极性大的乙酸乙酯和乙醇中，而非极性的石油醚中含量较少。同时，多糖易溶于水，因此此次试验以大极性的水为提取溶剂，以超声法提取松露多糖，并对不同干燥方式处理的多糖提取物的抗氧化活性进行了评价。

3.2 结论

经不同干燥方式处理的松露多糖提取率与干燥时间具有相关性，即干燥时间越长，松露多糖的提取率越低；不同干燥方式对松露多糖含量的影响为真空冷冻干燥＞热风干燥＞真空干燥＞微波干燥。4种干燥方式处理的松露多糖提取物对DPPH·、ABTS+·均具有较好的清除能力，且对ABTS+·的清除效果优于相同质量浓度下对DPPH·的清除效果。真空冷冻干燥后松露多糖提取物对DPPH·、ABTS+·的清除作用最强，热风干燥作用最弱。

综上所述，真空冷冻干燥对松露多糖保留率最高、耗时最少、抗氧化活性最强，是新鲜松露干燥的最佳方式。