田苡箫，李 菁

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 风湿免疫科 风湿免疫病学教育部重点实验室国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心， 北京 100032)

反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)是目前分析基因表达水平的黄金标准，却经常表现出重复性欠佳的问题，选取合适的内参基因有助于改善这一情况[1]。大动脉炎(Takayasu arteritis，TAK)是以主动脉及其一级分支受累为主，表现为非特异性慢性肉芽肿性血管炎的系统性疾病。糖皮质激素、免疫抑制剂是治疗TAK的常用药物，这二者均可能导致TAK患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中管家基因表达水平的改变。在用相对定量qPCR分析TAK患者与健康对照(healthy control,HC)人群的基因表达差异时，合适的内参基因有利于得到更稳定、更准确、组间差异更小的结果[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：人淋巴细胞分离液(深圳市达科为生物工程有限公司);Trizol Reagent(Ambion公司);TaKaRa RR047A、引物(苏州金唯智生物科技有限公司，纯化方式为PAGE-Plus);Easy dilution(TaKaRa 9160)、iTaqTMUniversal SYBR® Green Supermix(Bio-Rad公司)。

1.1.2 外周血样本：2019年4月至2019年6月于北京协和医院风湿免疫科门诊纳入TAK患者18例，均符合美国风湿病协会1990年的诊断标准[2]，采用1994年NIH标准评估疾病活动性[3]，纳入健康对照9人。样本的采集和使用经过北京协和医院伦理委员会的批准(S-478)，受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分离、RNA的提取和反转录：用无热原的采血针和真空乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(Becton Dickinson公司)采集肘部静脉血，常温放置，8 h内用密度梯度离心法分离PBMC。用Trizol法从PBMC中提取总RNA，紫外分光光度法检测RNA的浓度和纯度，取A260/A280在1.8～2.1、琼脂糖凝胶电泳可见28 S和18 S条带清晰无弥散、28 S条带亮度约为18 S条带亮度2倍的样本，除去基因组DNA(gDNA)之后进行反转录。……