张 蕊 李 博 李 旭 尚文静 韩迎春 程 琨 刘 娜* 郑文明，*

(1.河南农业大学 生命科学学院，郑州 450002；2.河南农业大学 小麦玉米作物学国家重点实验室/河南粮食作物协同创新中心，郑州 450002)

叶锈病是小麦三大锈病之一，是由叶锈菌(Pucciniareconditaf. sp.tritici)引发的一种病害，其分布范围广、发生频繁，每年在全世界各个小麦种植区大面积流行，对小麦产量造成严重损失[1]。为抵御病原物的攻击，植物进化出复杂的信号感知、传导和抵抗机制，例如在无毒性病原体感染过程中，植物抗性蛋白识别病原体的效应因子,并在感染部位启动超敏反应(HR)和局部程序性细胞死亡，超敏反应包括活性氧(ROS)爆发、信号分子的传递及病程相关蛋白(PR)的诱导等[2]。过多的ROS积累会破坏细胞膜结构和功能，而细胞中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等可使ROS维持在正常水平[3]。抗病品种小麦受到稻瘟病感染后，活性氧爆发程度低于感病品种，CAT活性仅在抗病品种中升高，而其他活性氧清除酶(SOD、POD、APX)活性在不同抗性小麦中都有所升高，在抗病小麦中的增幅大于感病小麦，表明在去除稻瘟病菌感染引起的过量活性氧累积过程中，有效的活性氧清除系统能够抑制真菌对细胞的损伤，从而有助于增强小麦抗病性[4]。

植物在受到某些病原物侵染时，会诱导病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)的表达，PR蛋白多为酸溶性、低分子量和抗蛋白酶分子，有助于植物在苛刻的条件下生存，大多数PR蛋白具有抗菌、杀虫和抗病毒活性，有些PR蛋白还具有β-1，3-葡聚糖酶或几丁质酶活性[5]。病程相关蛋白基因PR1、PR2、PR5是植物抗病基因介导的抗病反应中的标志基因[6]，相关小麦抗病性的研究主要有：白粉菌侵染小麦显著诱导了小麦中病程相关蛋白PR1、PR2、PR5的转录表达[7]。条锈菌的致病因子Pst-milR1可通过抑制PR2的表达来抑制植物的免疫应答反应[8]。王华忠等[9]研究发现，小麦抗病反应过程中的2个重要的PR蛋白基因(几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因)对白粉病菌入侵和吸器形成均有抑制作用，在一定程度增强了小麦对白粉病菌的抗性。

病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术在植物抗病研究中被广泛应用，该技术是基于转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)，可引起内源mRNA特异性降解，其原理是在病毒载体中插入特异性目的片段，侵染宿主植物后，植物表现出目的基因表达水平下降或基因功能丧失[10]。利用VIGS技术可在相对快速的时间内沉默目的基因，该技术已被用于单子叶植物和双子叶植物中[11]。大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)系统最初是在大麦上被开发出来，现在广泛应用于研究小麦的基因功能[12]。王新博等[13]利用BSMV-VIGS系统沉默小麦TaEF-1α基因，与正常植株相比，VIGS沉默处理后的植株对干旱胁迫更加敏感，因此TaEF-1α基因可能在小麦干旱胁迫响应中发挥关键作用，Feng等[14]利用VIGS技术沉默TaMDHAR4基因后发现，小麦受到条锈菌感染部位坏死面积比例增加，对条锈菌的抗性受到了抑制。

本实验室前期在对接种叶锈菌后的小麦转录组数据分析中发现，TaSPX3基因的转录水平受到叶锈菌侵染诱导，推测TaSPX3基因可能参与小麦抗叶锈病过程。TaSPX3基因属于SPX基因家族,该基因家族共有结构域最早是从酵母gpa1抑制子(SYG1)、酵母周期依赖性蛋白(PHO81)和人的异嗜性多变逆转录病毒受体(Xpr1)中发现的，因此以这三者首字母命名。SPX蛋白结构域较为保守，平均长度为165个氨基酸，组成3个亚结构域，每个亚结构域由30～40个氨基酸组成，3个亚结构域的序列相似性较低。SPX基因家族通常在维持细胞内磷稳态中发挥着重要作用，参与植物低磷胁迫应答[15]。研究发现小麦SPX基因可能参与小麦高温抗条锈病[16]。目前关于TaSPX3参与小麦抗叶锈病过程的作用机制研究尚未见报道，因此，为深入了解TaSPX3基因在小麦抗叶锈病中的作用，本试验拟采用BSMV-VIGS系统沉默中国春和郑麦9023中TaSPX3基因，在沉默植株上接种叶锈菌，并利用qRT-PCR技术对TaSPX3的表达水平进行检测，观察小麦对叶锈菌侵染的反应，检测小麦抗病相关基因PR2、CAT的表达水平，以期为进一步明确TaSPX3的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦品种为中国春和郑麦9023；供试烟草品种为本生烟；供试菌株为小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf. sp.tritici)HnZU18-3单孢系，该菌系由本实验室鉴定并保存。

1.2 构建大麦条纹花叶病毒介导的TaSPX3基因沉默体系

本试验中所用载体有α、β、γ和γ-PDS，载体由河南农业大学农学院王道文教授课题组提供。TaSPX3基因cDNA全长789 bp，由本实验室前期从郑麦9023中克隆得到。从TaSPX3基因cDNA上选取122 bp的特异性序列作为VIGS的靶标序列，设计特异性引物(表1)，从实验室已有的TaSPX3-T重组质粒中克隆出带有LIC接头的目的片段，利用T4 DNA连接酶将目的片段与线性化γ载体(限制性内切酶ApaⅠ处理)连接，连接产物转化大肠杆菌，设计引物VIGS-Test-F/R(表1)进行菌落PCR筛选阳性克隆，送至公司测序验证阳性克隆，重组质粒命名为γ-TaSPX3。

分别将γ (Empty vector)、γ-PDS、γ-TaSPX3 3种质粒与α、β 按照1∶1∶1的比例混匀，组装成BSMV∶EV、BSMV∶PDS、BSMV∶TaSPX3 3种VIGS病毒，利用烟草转染方法，沉默中国春和郑麦9023中的基因[17]，由于本实验室前期研究发现中国春和郑麦9023对叶锈病的抗性不同，郑麦9023对叶锈病的抗性比中国春强，因此选择这两个品种小麦来进行研究。接种BSMV∶PDS的小麦用于验证本试验所用的BSMV-VIGS沉默体系是否有效，PDS基因是小麦八氢番茄红素脱氢酶基因，若该基因被沉默，小麦叶片则会出现白化。接种BSMV∶TaSPX3的小麦为试验组，用于研究TaSPX3基因被沉默后小麦对叶锈菌的抗性。接种BSMV∶EV的小麦中没有沉默任何基因，作为以上两种小麦的对照。VIGS病毒接种于小麦第二片叶，接种14 d后，观察接种BSMV∶PDS的小麦叶片出现白化现象，再将实验室保存的叶锈菌孢子均匀洒在接种BSMV∶EV和BSMV∶TaSPX3的小麦叶片上，在接种锈菌后的第7 天，观察小麦叶片感病表型，分析TaSPX3基因沉默对小麦抗病性的影响。

1.3 qRT-PCR

沉默植株和对照组接种叶锈菌后0、12、24 h分别取样，利用Trizol Reagent(康为世纪生物科技有限公司，CW0580S，北京)提取样品RNA，利用HiScriptⅡQRTsuperMix for qPCR(南京诺唯赞医疗科技有限公司, 223-01，南京)试剂盒，按提供的操作流程，将RNA反转录成cDNA。以小麦26S为内参基因，检测TaSPX3基因和小麦抗病相关基因PR2、CAT的相对表达量，检测TaSPX3基因的沉默效果，分析TaSPX3基因沉默对抗病相关基因转录水平的影响。用于荧光定量的引物见表1。

目的基因的相对表达水平按照2-ΔΔCT方法计算，每组试验进行3 次独立的生物学试验，利用T-test方法对结果进行显著性分析。

表1 本试验所用引物Table 1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 VIGS重组质粒的构建

以TaSPX3-T重组质粒为模板，利用引物VIGS-122-F/R 进行PCR反应，克隆得到122 bp的特异性靶标序列，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对PCR产物进行回收，将回收产物与线性化的γ载体连接，连接产物转化大肠杆菌，挑选单克隆菌落，利用引物VIGS-test-F/R 筛选阳性克隆，将阳性克隆送至公司测序后，与靶标序列比对完全一致，表明重组质粒构建成功。

2.2 BSMV-VIGS沉默体系有效性验证

为验证本试验所用的BSMV-VIGS体系是否有效，对2 种小麦接种BSMV∶PDS病毒，以沉默小麦叶片中的PDS基因，并与接种BSMV∶EV病毒后的小麦叶片作对照，结果见图1。如图1所示，中国春和郑麦9023中接种BSMV∶PDS的小麦叶片均出现白化现象，表明本试验所用的BSMV-VIGS沉默体系能够有效沉默小麦基因。

图1 分别接种BSMV∶EV和BSMV∶PDS的小麦叶片表型Fig.1 Phenotypes of wheat leaves respectively inoculated with BSMV∶EV and BSMV∶PDS

2.3 TaSPX3基因沉默效果检测

为进一步验证TaSPX3基因是否被有效沉默，利用qRT-PCR技术检测感染VIGS病毒的中国春和郑麦9023接种叶锈菌后的0、12、24 h叶片中TaSPX3基因的表达水平，结果如图2所示：在2种遗传背景下，与感染BSMV∶EV的小麦相比，感染BSMV∶TaSPX3病毒的小麦在接种叶锈菌后的0、12、24 h，TaSPX3基因的表达水平均显著降低，表明接种BSMV∶TaSPX3病毒有效沉默了中国春和郑麦9023中的TaSPX3基因。

*为显著差异P<0.05，**为极显著差异P<0.01。* Significant difference P<0.05，** Extremely significant difference P<0.01.图2 感染VIGS病毒的中国春(a)和郑麦9023(b)接种叶锈菌后TaSPX3基因相对表达水平Fig.2 Relative expression level of TaSPX3 after inoculation of leaf rust in Chinese Spring (a) and Zhengmai 9023 (b) infected with VIGS virus

2.4 基因沉默后小麦抗病性研究

为进一步研究TaSPX3基因在小麦抗叶锈病中的作用，给野生型和感染VIGS病毒小麦接种叶锈菌，7 d后观察叶片感病表型(图3)。如图3所示，2 种遗传背景下，感染BSMV∶TaSPX3病毒的小麦叶片明显比野生型小麦和感染BSMV:EV的小麦叶片上产生更多的叶锈菌孢子，表明TaSPX3基因沉默的小麦对叶锈病的抗性降低。

图3 野生型小麦和感染VIGS病毒的小麦接种叶锈菌后叶片表型Fig.3 Leaf phenotypes of wild-type wheat and wheat infected with VIGS virus inoculated with leaf rust

接种锈菌后0、12、24 h检测了6 个小麦抗病相关基因的表达量，其中PR2和CAT的表达量差异显著。如图4(a)所示，感染BSMV∶EV中国春的PR2基因在接种锈菌12 h时显著上调，而感染BSMV∶TaSPX3中国春的PR2基因在24 h时才显著上调，中国春中TaSPX3基因被沉默后接种叶锈菌，PR2基因的表达受到了抑制；如图4(b)所示，感染BSMV∶TaSPX3郑麦9023接种叶锈菌后PR2基因的表达显著低于感染BSMV∶EV的郑麦9023，表明TaSPX3基因的沉默显著抑制了郑麦9023中PR2的表达；如图4(c)、(d)所示，在2种遗传背景下，CAT基因在感染BSMV∶TaSPX3小麦中的表达量显著低于感染BSMV∶EV的小麦，表明中国春和郑麦9023中TaSPX3基因的沉默使叶锈菌侵染后CAT基因的表达显著下调。

(a) 中国春 PR2基因；(b) 郑麦9023 PR2基因；(c) 中国春 CAT基因；(d)郑麦9023 CAT基因。(a) PR2 in Chinese Springt; (b) PR2 in Zhengmai 9023; (c) CAT in Chinese Spring; (d) CAT in Zhengmai 9023;*为显著差异P<0.05，**为极显著差异P<0.01。* Significant difference P<0.05，** Extremely significant difference P<0.01.图4 感染VIGS病毒的小麦接种叶锈菌后PR2和CAT基因相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of PR2 and CAT in wheat infected with VIGS virus inoculated with leaf rust

以上研究结果表明，TaSPX3基因沉默抑制了抗病相关基因PR2、CAT的表达，从而降低了小麦对叶锈菌的抗性，因此TaSPX3基因正调控小麦对叶锈病的抗性。

3 讨论与结论

病程相关蛋白广泛存在于不同植物中，是植物防御反应中的重要成员。其中PR2是β-1,3-葡聚糖酶，能够催化β-1,3-葡聚糖多聚体水解，可直接攻击入侵菌丝壁，并且它催化的水解产物可以作为信号分子，进一步诱导防御，从而增强植物抗病性[18]。信号分子水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)均能诱导PR2基因的表达，有研究显示PR2可能通过SA和ABA介导的信号通路参与小麦抗叶锈病反应[19]。本研究中TaSPX3基因的沉默抑制了PR2的转录表达，表明TaSPX3基因可能通过调控PR2的表达影响入侵菌丝在寄主细胞内的生长，诱导植物防御反应，从而调控植物的抗病性。

植物细胞氧化还原过程是由复杂的遗传网络调控，过氧化氢酶(CAT)是最重要的活性氧清除酶之一，CAT在清除各种代谢途径产生的H2O2积累方面发挥重要作用[20]。高芬等[21]将拮抗菌制成液体培养基，黄瓜、西瓜、青椒3 种植物经拮抗菌液体培养基处理后，其中CAT和β-1,3-葡聚糖酶活性明显提高，增强了植物抗病性。本研究利用BSMV-VIGS体系在中国春和郑麦9023这2种遗传背景下沉默小麦基因，构建了BSMV∶EV、BSMV∶PDS、BSMV∶TaSPX3 3种VIGS病毒，接种BSMV∶PDS的小麦叶片出现白化现象，表明该体系能够有效沉默小麦基因；通过qRT-PCR方法检测TaSPX3基因的相对表达量，发现感染BSMV∶TaSPX3的小麦中TaSPX3基因表达水平显著低于对照组，表明BSMV-VIGS体系有效沉默了TaSPX3的表达。对感染BSMV∶TaSPX3的小麦接种叶锈菌，观察到BSMV∶TaSPX3小麦叶片上锈菌孢子堆相比于对照组显著增多，检测了多个抗病相关基因表达水平后发现PR2和CAT的表达水平在基因沉默植株中明显受到了抑制，表明沉默TaSPX3基因可抑制PR2和CAT的表达，可能是降低小麦对叶锈菌的抗性的途径。如图3所示，郑麦9023对叶锈菌的抗性比中国春强，但在2 种遗传背景下，TaSPX3基因沉默后，都降低了对叶锈菌的抗性，PR2和CAT的表达均受到了抑制，表明TaSPX3基因增强小麦对叶锈病的抗性并无品种间的差别，可能具有广谱抗性。

本研究表明，TaSPX3基因可能正调控PR2、CAT并参与小麦对叶锈病的抗性机制。研究结果为下一步深入阐明TaSPX3基因在调控小麦抗病机制中的作用提供了基础。