李逸轩，付君婷，邓小刚，段欣汝，韩淳，吕鹏飞，3，邝仕成，2，肖莎

1.海南医学院公共卫生学院环境卫生与职业医学教研室，海南 海口 571199；

2.海南医学院附属海南医院药学部，海南 海口 570311；

3.海南医学院第一附属医院乳腺外科，海南 海口 570102

肺癌是全球癌症患者死亡的首要原因[1]，如何控制和预防肺癌已成为全世界范围内的关注焦点。由于肺癌的发生和恶化是多种因素导致的，并且没有很好的特效药，因此近几年肺癌的患病率和死亡率均呈现升高趋势。在肺癌的诊疗过程中，早期肺癌由于不具有典型的临床症状(如咳嗽，胸痛等)，从而导致检出率较低，而中后期肺癌治疗的预后效果并未能达到人群预期效果，且对患者机体产生较大伤害，较高的花费同样为社会的医疗增添负担，因此探寻可筛查出早期肺癌的生物标记物具有重要的临床意义。目前临床上仍无法对早期肺癌做出准确的筛查，而非编码小分子RNA在一些恶性肿瘤中的表达存在特异性，研究人员认为这一发现对深入探讨更加高效的肺癌早期诊断具有重要的意义。

非编码小分子RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长21～25个核苷酸的小分子，对机体的生长发育、细胞繁殖、代谢、凋亡等生理过程发挥着重要作用[2]，其作用机制是特异性结合靶基因mRNAs上的3'非编码区域，干扰mRNAs在转录后的基因表达或蛋白质翻译，从而干扰一系列的正常基因表达的生物学进程。在肿瘤的发生与发展过程中，miRNA起着致癌或者抑癌基因的作用，而引起肿瘤组织的非正常增生以及浸润[3]。目前研究发现在肝癌、甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌以及肺癌等多种实体性恶性肿瘤中，miRNA-486、miRNA-200和miRNA-10b在肿瘤组织中存在不同程度的上调或下调的表达状态，结果发现，肝癌患者机体miRNA-486的表达量显著降低[4]，miRNA-10b在肺癌患者血液中呈低表达[5]，可以用于早期筛查的重要指标。本研究旨在探讨miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b在肺癌患者与非肺癌患者血液中表达的差异性，分析其在肺癌患者血液中的表达与肺癌遗传易感性是否有关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用病例对照研究方法，选择2012年1月至2016年7月期间海南医学院附属海南医院呼吸内科的93例肺癌患者作为病例组，41例非肺癌患者作为对照组。在签署知情同意书后，开展问卷调查，记录人口学特征、既往病史、家族病史及生活方式(吸烟、饮酒)等一般情况。规定平均每天吸烟大于1支的并且超过半年的定义为吸烟者，规定平均每天饮酒大于1两的并且超过半年的定义为饮酒者。

1.2 血液样本的采集 利用经过枸橼酸钠抗凝处理过的真空采血管采集研究对象的外周静脉血6 mL，4℃冰箱保存，采集血液样本当天完成其miRNA提取。

1.3 miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的相对表达水平检测 遵循北京全式金生物技术(Trans-Gen Biotech)有限公司提供的操作程序提取miRNA，使用由TransGen Biotech提供的反转录试剂盒反转录成cDNA，再使用miRNAreal-time PCR反应试剂盒(Trans-Gen Biotech)进行扩增反应，总体系为20 μL，PCR正向引物 (10 μmol/L)0.4 μL，PCR 反向引物 (10 μmol/L)0.4 μL，2×TransStart®Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Passive Reference Dye(50×)(optional)5.2 μL，ddH2O 2.0 μL，DNA模板2.0 μL。以U6作为内参考基因，血液miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b水平的相对表达量采用2-△Ct表示，△Ct486=Ct486-CtU6，△Ct200=Ct200-CtU6，△Ct10b=Ct10b-CtU6。汇总3次独立实验结果，进行统计学分析。

1.4 统计学方法 利用EXCEL2010、SPSS25.0软件进行数据分析。计量资料中满足正态性分布的采用均数±标准差()描述，组间比较采用t检验，不满足正态性分布的采用中位数和四分位间距[M(P25，P75)]描述，组间比较采用Wilcoxon秩和检验，计数资料采用例数描述，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的基本情况比较 两组患者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两组患者的基本情况比较

2.2 两组患者的血液miRNA相对表达水平比较 病例组患者的血液miRNA-486相对表达水平明显低于对照组、miRNA-10b相对表达水平明显高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。但两组患者的血液miRNA-200相对表达水平比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，见表2。

表2 两组患者的血液miRNA相对表达水平比较[M(P25，P75)]

2.3 病例组患者血液中miRNA的相对表达水平与临床特征的关系 病例组患者血液中的miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b相对表达水平在性别、年龄、吸烟史、饮酒史方面比较差异均无统计学意义 (P＞0.05)，见表3～表5。

表3 病例组血浆中miR-486的表达与临床特征的关系[M(P25，P75)]

?images/BZ_14_1270_276_2266_334.png性别-0.1890.850男女35.25(33.21，36.78)35.13(33.35，36.95)年龄(岁)0～60 61～100吸烟史-0.0080.994 35.24(33.39，36.87)35.16(33.17，36.69)-0.3830.702有无35.21(32.26，36.85)35.11(34.21，36.68)饮酒史-0.6800.496有无34.81(32.31，36.17)35.17(33.30，36.80)

?临床特征性别miR-200Z值-0.997 P值0.319男女35.54(34.00，36.86)35.78(34.75，37.69)年龄(岁)0～60 61～100吸烟史-0.1940.846 35.44(34.27，36.98)35.73(33.96，36.93)-0.6040.546有无35.59(33.94，36.91)35.69(34.27，37.61)饮酒史-1.3310.183有无34.71(34.10，37.33)36.07(34.27，36.94)

3 讨论

由于临床上对肺癌的诊断多依靠病理检验取患者的组织进行活检，会对患者造成机体的创伤且对早期肺癌进行筛查时无法做到大面积推广，血清标记物用于筛查早期肺癌具有创伤小、高效性和易于推广的特点。miRNA一直作为国内外学者近几年研究肿瘤作用的热点相关分子，均有大量研究实验证明miRNA分子可以作为特异性诊断肿瘤的生物标志物，其中miR-486、miRNA-200、miRNA-10b是与肿瘤发生相关的重要生物标志物。本次研究前期采用高通量测序技术检测海南地区汉族肺癌患者和对照患者血液中差异表达的miRNA，在初次实验采用高通量测序时研究发现miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的表达差异性显著，且均呈下调状态[6]。因此，研究人员通过real-time PCR法检测93例肺癌患者和41例非肺癌患者血液miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的表达水平，进一步验证高通量测序结果。

本研究结果发现miRNA-486在两组患者血液中的表达具有差异性，肺癌患者血液中miRNA-486的表达量显著低于对照组患者与诸多学者研究结论相一致。杨阳等[7]和姜溪[8]同样发现在肺癌患者血浆中miRNA-486的表达下调，可以作为肺癌潜在筛查及预后的生物指标，黄馨萍等[4]、何佳等[9]研究发现miRNA-486在肝癌组织中低表达，安学凤等[10]研究结果显示早期乳腺癌患者的血清中miR-486呈低表达，可以作为特异性诊断早期乳腺癌的生物标志物。另外，本研究发现miRNA-10b在肺癌患者血液中相对表达水平显著高于对照组。杨云龙等[11]研究也发现非小细胞肺癌患者外周血单核细胞中miRNA-10b的表达量显著高于健康者，可作为非小细胞肺癌的早期筛查和治疗的重要指标。miRNA-200家族在肿瘤患者体内是一个重要的参考指标，其包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141 和 miRNA-429[11]。邓超等[12]研究提示病例组患者血清中miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相对表达量显著低于健康组。JING等[13]通过transwell和尾静脉注射法测定miR-200c和USP25在迁移/侵袭和肺转移形成中的作用，发现miR-200c可通过抑制USP25表达对，从而起到对非小细胞肺癌发挥肿瘤抑制的作用。但在探讨miRNA-200在肺癌患者血液中相对表达时，本研究并未发现miRNA-200在两组患者血液中的表达有显著性差异。对比其他学者的实验过程，本组研究人员探讨其原因可能是没有进行miRNA相应家族各个指标的分析，仅仅进行了一个综合表达量的检测。提示在今后的研究中应进一步探讨肺癌患者血液中miRNA-200各家族其他指标的表达量。

本研究尚存在一定的不足之处，在深入探究病例组miR-486和miRNA-10b的表达情况与其性别、年龄、吸烟史、饮酒史的关联时，结果均不具有统计学意义。分析其原因可能为研究样本数量过少，存在偏倚现象，在以后的研究中应考虑扩大样本容量。

综上所述，miRNAs在肺癌发生发展过程中起着癌基因或抑癌基因的作用也预示着它将为肺癌患者早期诊断提供了可能。miR-486和miRNA-10b可作为肺癌遗传易感性生物标志物。