高 锋，何明霞，张春霞，刘 静，许欣景，曹 旸

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100；2.云南省景洪宏臻农业科技有限公司，云南景洪666100）

暗褐网柄牛肝菌Phlebopus portentosus（Berk.&Broomo）Boedijn，又名黑牛肝菌，隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌（Agaricomycetes）牛肝菌目（Boletales）小牛肝菌科（Boletinellaceae）脉柄牛肝菌属（Phlebopus），分布于斯里兰卡、越南、印度尼西亚、泰国、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰等国家，国内的广西、海南、云南等省区都有分布［1-7］。其子实体味道鲜美，营养丰富，具有很高的经济价值。相对于其他的分子标记，SSR标记的变异速度更快，适用于食用菌生产菌株的鉴定及遗传多样性的分析。在前期的工作中，我们使用由基因组数据开发的15个SSR标记对33个生产菌株进行了鉴定，由于样品数量及采样范围的影响，仅有5个标记表现出了中度多态性特征［8］。为此，在进一步的工作中，我们扩大了SSR标记及样品的筛选范围，以期寻找到具有更好的多态性、稳定性和重复性，能够更充分反映暗褐网柄牛肝菌遗传多样性及群体遗传学特征的SSR分子标记。

1 材料和方法

1.1 样品来源

157样品来自12个地理群体，涉及云南、广西、四川三个省区，部分来自澳大利亚和新西兰。

1.2 基于基因组数据的SSR引物设计和筛选

根据文献资料，SSR单元的重复次数越高，其具有高多态性的可能越大［9］。因此，本次开发标记主要针对二碱基重复10次以上，三碱基重复7次以上，四碱基重复6次以上，五碱基重复6次以上，及六碱基重复6次以上的SSR标记，PCR产物长度小于600 bp。具体步骤如下：

a.运用MISA软件搜索SSR，以暗褐网柄牛肝菌基因组［10］contig序列为输入文件，分别设置软件的definition参数（重复单元/最小重复数）为2/10、3/7、4/6、5/6和 6/6，并将 interruptions参数设置为600，即间隔小于600 bp的两个SSR在搜索中将被划为一个compound SSR，其余为perfect SSR。

b.设置MISA软件的definition参数为1/8、2/5、3/4、4/4、5/4和6/4，interruptions参数为 600，对基因组contig数据再次进行搜索。

c.选取步骤a中得到的perfect SSR，与步骤b所得结果进行对比，若该位点在步骤b结果中为compound SSR，则剔除该位点，其余位点可用于PCR引物设计。该步骤目的在于排除PCR产物中存在的多个SSR导致分型结果不准确。

d.选取步骤c中筛选出的SSR位点及其上下游各600 bp的侧翼序列，运用Primer Premier 6软件进行引物设计，并将产物长度控制在600 bp以下。

e.运用本地blastn程序，将步骤d中获得的引物序列与基因组序列进行比对，确保该引物在基因组中有唯一的配对位点。

从每个地理群体样品中随机选取2个样品，共20个样品，对上述引物进行预实验。

采用两轮PCR的方法：第一轮，在上述引物对的正向引物上接上M13F接头，与相应的反向引物一起进行PCR，退火温度值平均61℃；第二轮，以带荧光标记（FAM或HEX）的M13F引物，与各特异性反向引物，对上一轮的产物进行第二轮PCR，退火温度值平均56℃。对获得的PCR产物进行电泳鉴定，获取鉴定胶图，确定模板浓度，加水稀释，在ABI3730测序仪上进行毛线管电泳。

1.3 SSR标记的多态性分析

利用筛选得到引物对全部样品进行PCR扩增，合成引物时在正向引物末端加上FAM或HEX荧光标记。PCR产物使用ABI 3730测序仪进行基因分型。

使用软件Gene mapper 4.1（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA），参照引物对应关系的核心碱基重复数进行数据准确位点的分析。采用Popgene 32计算等位基因数、有效等位基因数、Shannon's信息指数、期望杂合度、观测杂合度。应用NTSYS-pc-2.10软件计算遗传相似系数，用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 引物设计及筛选结果

基于基因组数据，共设计得到43对SSR引物（表1），其中：两碱基单元的位点4个，三碱基单元的位点29个，四碱基单元的位点4个，五碱基单元的位点1个，六碱基单元的位点5个。PCR产物的长度为114～588 bp。

在预实验样品中，根据毛细管电泳结果，选取扩增成功率高、无干扰峰、多样性高的引物作为正式试验的引物。最终，由43对引物中共筛选得到 30对引物，编号分别为：SSR01，SSR02，SSR03，SSR04，SSR05，SSR06 ，SSR07，SSR08，SSR09，SSR11，SSR12，SSR13，SSR14，SSR16，SSR17，SSR18，SSR20，SSR22，SSR25，SSR26，SSR27，SSR30，SSR31，SSR32，SSR33，SSR36，SSR42，SSR43，SSR47，SSR50。其中，无两碱基单元的位点，三碱基单元的位点22个，四碱基单元的位点4个，五碱基单元的位点1个，六碱基单元的位点3个。PCR产物的长度为114～561 bp。

表1 由基因组数据中开发的43对引物

2.2 SSR标记的多态性分析

30对引物在供试的157个样品中均表现出多态性（表2），共检测到229个等位基因，每个位点4～15个，平均7.61个；有效等位基因数介于1.58～7.01，平均值3.59；观测杂合度介于0.18～0.8，平均值0.5；期望杂合度介于0.37～0.86，平均值0.67；Shannon's信息指数介于0.71～2.19，平均值1.43。以上指标反应出这30个SSR位点均为高度多态性位点。

结果显示，157个样品共有147种多位点分子表型。共享多位点分子表型的样品分别来自同一采样地点，推测来源于同一菌丝无性繁殖系。从聚类结果来看（图1），样品并未按地理群体聚在一起，说明各个地理群体间有基因交流。来自澳大利亚和新西兰的样品未与来自中国的样品完全分开。

图1 基于30个SSR标记的UPGMA聚类分析

3 结论

SSR在真核、原核生物中广泛存在，是重要分子的标记，在基因分型、群体遗传学、遗传图谱等方面被广泛应用。有一些SSR还具有一定的功能性，例如改变表型特征，调控基因表达等等。因此近年来关于SSR全基因组扫描方面的研究也越来越多。在本研究中，从暗褐网柄牛肝菌基因组中设计SSR标记引物时，通过控制碱基单元重复次数，区别compound SSR和perfect SSR，将PCR产物长度限制放宽至600 bp，及在基因组中比对引物的唯一性等手段，获得了43对引物。经过实际的PCR扩增和基因分型实验验证，43对引物中有30对引物都是具有高度多态性的，在157个样品中形成了147种多位点分子表现。说明本研究中所采用的从基因组数据中开发SSR标记引物的办法是行之有效的，相比于在基因组中随机挑选SSR位点设计引物［8］获得高多态性位点引物的概率更高。相较于低多态性的SSR标记，高多态性的SSR标记在菌株亲缘关系鉴定，辅助遗传育种和商业品种DNA指纹图谱构建中，包含更大的信息量和分辨率，能更好地发挥分子标记的作用，因此在未来的工作中，还应继续寻找不同的方法用于黑牛肝菌高多态性SSR标记的开发。