彭婉婉 马忠杰 王 彦 高 帆 许贵善

（塔里木大学动物科学学院/塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

新疆是多民族聚居区，对牛羊肉等畜产品需求量极大。新疆南疆地区由于可利用耕地面积少，种植业结构单一，导致优质粗饲料资源极度匮乏，已成为制约南疆草食畜牧业发展的瓶颈，因此开发利用新型饲料资源显得更加重要[1-3]。葡萄渣是葡萄酿酒后的副产物，包括葡萄籽、葡萄皮和葡萄梗，是南疆有待开发利用的特色饲料之一[4-5]。研究表明，日粮中添加葡萄渣可提高氮的利用率，但葡萄渣中含有的抗营养因子单宁会影响动物的采食量和营养物质消化率，因此单宁含量是葡萄渣开发利用的制约因素[6-8]。

瘤胃微生物包括细菌、真菌和原虫，在反刍动物的饲料消化过程中起着重要的作用。与细菌相比，瘤胃中真菌数量较少，但对饲料纤维的降解至关重要[9]。真菌能够利用其特有的假根系统，优先附着于粗饲料的木质化组织，同时分泌大量纤维素酶、木质素酶和其他水解酶[10]，这些酶可裂解植物木质化组织，从而有利于纤维物质的降解，并促进其他瘤胃微生物对底物的附着和降解[11]。已有研究证实，部分真菌对单宁具有更强的耐受性[12]，部分真菌能够降解单宁，例如木质素降解菌(Ceriporiopsis subvermispo⁃ra)和粪生黑蛋巢(Cyathus stercoreus)可使单宁含量分别降低 70% 和 47%[13]，青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、多孔菌属(Polyporus)和栓菌属(Trametes)均属于产单宁酶的真菌,且曲霉属是目前最具有商业开发价值的产单宁酶菌属[14]，但反刍动物瘤胃中的真菌属是否能够降解单宁还未见报道。高通量测序技术通过测定真菌核糖体DNA的ITS区，进而比较不同真菌间进化发育关系[15-16]，促进了瘤胃真菌菌群结构的研究。本试验在多浪羊日粮中添加不同比例的葡萄籽，采用高通量测序技术分析多浪羊瘤胃真菌菌群结构的变化，探究添加富含单宁的葡萄籽对多浪羊瘤胃真菌菌群结构的影响，以期为葡萄籽资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

本试验于2019年4月8日—5月8日在塔里木大学动物科学学院试验站进行。

1.2 试验日粮

参考美国 NRC(2007)[17]体重 30 kg、日增重 100 g/d的肉羊营养需要，按照“等能等氮”的原则，设计5种添加不同比例葡萄籽的日粮：0%（对照组）、4%（I组）、8%（II组）、12%（III组）、16%（IV组），日粮配方见表1。试验所用葡萄籽来自伊犁某葡萄酒厂，自然干燥后用中草药粉碎机粉碎，与各精料原料在混合机内搅拌混匀备用。

1.3 试验动物及饲养管理

试验选用15只1.5岁左右，体重41.0±1.0 kg，安装永久瘤胃瘘管的健康多浪羊羯羊。在晨饲前空腹称重，根据体重相近原则随机分为5组，每组3只羊，每组饲喂1种日粮，预饲期15 d，早09：00和晚21：00各饲喂一次，按照维持水平1.2倍饲喂。先喂精料，后喂粗料。试验羊单笼饲养，自由饮水，试验开始前一个月每只羊注射1 mL伊维菌素驱虫。

表1 5种葡萄籽日粮组成及营养成分(干物质基础)

1.4 样品的收集

正试期的第10 d在晨饲前（早上8:30）采集瘤胃食糜。每只羊采集10 mL瘤胃食糜，保存于-80℃，送至上海美吉生物医药科技有限责任公司进行高通量测序。

1.5 DNA的提取

将样品在冰上融化后，充分混匀并离心，取适量样品，按照试剂盒的操作说明抽提瘤胃液中微生物群落总DNA，以1%琼脂糖凝胶，5 V/cm的电压，电泳20 min，判断提取效果，DNA提取试剂盒为FastDNA SPIN kit for soil(MP Biomedicals,Solon,美国)。

1.6 PCR扩增引物

对真菌ITS1区进行rDNA扩增，扩增引物为ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)及ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGTGC-3′)。扩增试验采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系。

1.7 生物信息学分析

使用Use-arch软件平台进行OTUs聚类，将真菌OTUs代表序列与Unite8.0/its_fungi(https://unite.ut.ee/)的真菌数据库进行比对。使用单因素方差分析法（one⁃way ANOVA）进行显著性检验，LSD多重比较差异，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果用平均值表示。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果鉴定胶图

从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增真菌DNA的ITS1区，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，取3 μL上样检测扩增产物，图1为真菌PCR扩增结果，如图可知，真菌的条带大小在250～500 bp之间。

图1 真菌PCR扩增结果

2.2 测序基本数据分析

由测序结果可得，真菌样本序列长度分布在161～340 bp，分布在 321～340 bp的真菌序列数目最高（图2a），序列大小略低于PCR扩增胶图结果，是因为扩增引物两端加入了barcorde，符合建库要求。由样本稀释曲线可看出，随着随机抽取测序数据量的增加，真菌样本稀释曲线趋于平缓，说明测序数据量足够。

图2 真菌样本长度分布和稀释曲线

2.3 真菌样本Alpha多样性指数

Alpha多样性用来表示样本内微生物群落的多样性，其中ace指数、chao指数代表菌群丰富度，数值越大，表示菌群丰富度越高；而shannon指数和simp⁃son指数代表菌群多样性，shannon指数越大，simpson指数越小，说明菌群多样性越高。由表2可知真菌各指数均在合理范围，说明数据可科学充分地反映瘤胃真菌菌群的实际情况。真菌Shannon指数IV组最大，显著性大于对照组、I组和III组（P<0.05），真菌simpson指数IV组显著低于对照组、I组和III组（P<0.05），说明IV组样本的菌群多样性较高。

表2 真菌样本Alpha多样性指数

2.4 真菌样本PCoA分析

图3为真菌OTUs水平的PCoA分析，即主坐标分析，对微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析，探索不同分组样本间群落组成的差异性。图中使用Bray-curts距离算法，不同颜色点代表不同分组的样本，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。由图可知，5组样本点较为聚集，Ⅳ组样本偏离整体，说明Ⅳ组真菌总体上OTUs水平群落组成较其他组有一定的差异。

图3 真菌OTUs水平PCoA分析

2.5 真菌样本OTUs数目

对OTUs进行物种分类学注释，共注释1 173种OTUs，分属于12个门，36个纲，82个目，162个科，287个属，456个种。由真菌样本Venn图（图4）可以看到，对照组、I、II、III、IV组测得真菌OTUs数量分别为322、258、489、408、718个，各组独有真菌OTUs数目为IV组>II组>III组>对照组>I组。

图4 真菌样本Venn图

2.6 真菌物种门水平相对丰度

将所有样本中相对丰度占比小于1%的物种合并，表3中为相对丰度最高的6种菌门。由表可知，多浪羊瘤胃真菌的优势菌门为新丽鞭毛菌门(Neocallimastigo⁃mycota)和子囊菌门(Ascomycota)，两个菌门在瘤胃真菌门中总相对丰度为90.18%～96.13%。II组、IV组新丽鞭毛菌门的相对丰度分别为37.00%、33.36%，较对照组降低了42.59%、48.24%（P>0.05）；II组子囊菌门相对丰度为53.18%，较对照组增加了78.76%（P<0.05）；IV组担子菌门(Basidiomycota)相对丰度为11.93%，较对照组增加了241.83%（P>0.05）；II组、III组和IV组被孢霉门(Mortierellomycota)相对丰度为0.94%、1.18%和0.81%，均高于对照组和I组（P>0.05）；与对照组相比，各试验组均发现了罗兹菌门(Rozellomycota)。

表3 日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊瘤胃真菌门水平组成的影响（%）

2.7 真菌物种属水平相对丰度

5组样本中共检测到287个菌属，表4为瘤胃真菌相对丰度较高的15个菌属。由表可以看出，瘤胃真菌相对丰度较高的10个属为厌氧鞭菌属(Anaero⁃myces)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、未注释粪壳菌纲(un⁃classified_c__Sordariomycetes)、枝孢属(Cladosporium)、未注释肉坐菌目(unclassified_o__Hypocreales)、Vish⁃niacozyma、支顶孢菌属(Acremonium)、未注释真菌(un⁃classified_k__Fungi)、阶菌属(Stephanonectria)、曲霉属(Aspergillus)。I组厌氧鞭菌属相对丰度最高为67.52%，较对照组增加34.42%（P<0.05），IV组厌氧鞭菌属相对丰度最小为15.93%，比对照组降低了68.29%（P<0.05）；梨囊鞭菌属相对丰度随日粮的变化，先降低然后升高，II组最低（2.82%），较对照组低79.68%；II组未注释肉坐菌目相对丰度、IV组未注释子囊菌门相对丰度均显著高于其余4组（P<0.05）；II组Latorua相对丰度最高，显著高于对照组、I组和IV组（P<0.05）；II组、III组IV组Vishniacozyma相对丰度较对照组增加了151.63%、97.28%和63.04%（P>0.05）。

表4 日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊瘤胃真菌属水平组成的影响（%）

3 讨论

本研究中，采用高通量测序技术检测各处理组的瘤胃微生物区系，稀释曲线随着测序数据量的增大趋于平缓(如图2a所示)，证明测序数据量充分，可进行数据分析。由样本Alpha多样性指数可知，5组样本瘤胃真菌菌群相对丰度、菌群多样性、菌群覆盖度均较高，说明本试验测序量满足试验要求，可以反映瘤胃真菌群落的多样性[19]。Mookiah等[20]体外研究表明，日粮中添加3%的单宁可降低瘤胃真菌菌群的多样性，其影响程度与单宁的分子量大小有关，日粮中添加1 265.8～652.2 Da的单宁可显著降低菌群多样性，但分子量为562.2 Da和469.6 Da时，未对真菌菌群多样性产生显著影响。本研究日粮中单宁含量3.45%（Ⅲ组）时，多浪羊瘤胃真菌菌群多样性与对照组相比无显著差异，当单宁含量为4.60%（Ⅳ组）时，多浪羊瘤胃真菌菌群多样性高于对照组，与前人体外研究结果不同，原因是本试验为体内试验，瘤胃中微生物种类较体外实验更为丰富，微生物在瘤胃中拥有较适宜的生长环境，所以不仅未降低瘤胃真菌的多样性，反而导致微生物多样性有所提高。

瘤胃真菌生长需要严格的厌氧环境，真菌对于日粮中纤维物质具有作用，同时真菌也能降解淀粉、糖原等物质[21]。本研究结果显示，担子菌门相对丰度随着葡萄籽添加量升高而升高，担子菌门属于有氧真菌，是栖息在饲料成分中的附生真菌，可能不直接参与瘤胃发酵，因此可根据环境变化而调整适应性[22-23]。吉武龙、张洁等[24-25]研究发现，奶牛瘤胃新丽鞭毛菌门、子囊菌门和担子菌门的相对丰度分别为16.09%、64.53%和16.23%，本试验中多浪羊的优势菌门与上述文献报道一致。Mookiah等[20]在体外研究中证明，单宁可显著降低两种新丽鞭毛科的相对丰度，本试验日粮中单宁含量2.30%（Ⅱ组）和4.60%（Ⅳ组）时，新丽鞭毛菌门相对丰度显著降低，但Ⅲ组新丽鞭毛菌门相对丰度相较对照组无显著性差异，可能是由于动物个体差异导致的，需通过扩大动物样本进一步深入研究。

厌氧鞭菌属和梨囊鞭菌属分类学上属于新丽鞭毛菌门。研究表明，奶牛瘤胃中厌氧鞭菌属、梨囊鞭菌属的相对丰度受日粮结构的影响[26]，Liggenstoffer等[27]分析草食动物消化道内厌氧真菌的组成，发现家养山羊瘤胃厌氧鞭菌属和梨囊鞭菌属的相对丰度分别为47.6%和32.8%，张洁、付子琳等[25,28]研究结果显示，舍饲条件下滩羊瘤胃梨囊鞭菌属相对丰度为19.93%～38.49%，本研究中，各组多浪羊瘤胃内厌氧鞭菌属相对丰度为15.93%～67.52%，梨囊鞭菌属相对丰度为2.82%～13.88%，相对丰度与以上研究略有不同，主要是由日粮和动物品种的差异造成。体外发酵试验中每克干物质中添加30 mg单宁（469.6～1265.8 Da）可提高瘤胃液中梨囊鞭菌属4（piromyces4）的相对丰度，但仅分子量为469.6 Da的单宁可增加梨囊鞭菌属 2（piromyces2）的相对丰度[20]。本研究中，各试验组梨囊鞭菌属（piromyces1）相对丰度与对照组无显著差异，但梨囊鞭菌属相对丰度随日粮的变化，先降低然后升高，与日粮中葡萄籽单宁含量有关，具体原因有待进一步研究。Vishniacozyma属于担子菌门，在II组、III组和IV组（单宁含量2.30%～4.60%）中相对丰度最高，与葡萄籽的添加量有关，有研究表明，Vishniacozyma是葡萄酒发酵过程中优势菌，适应性较强，可在-3℃环境下生存[29,30]。谷物降解过程中可产生霉菌，曲酶属是主要的霉菌，工业上使用曲霉生产各种酶制剂如淀粉酶、蛋白酶和果胶酶等[31]，霉菌对单宁有一定的耐受性，在单宁酸等诱导物存在情况下可发酵产生具有水解催化能力的单宁酶[32]。本研究中，I组（单宁含量1.15%）曲霉属相对丰度最高，证明瘤胃中通过添加葡萄籽（富含单宁）能诱导曲霉属生长，随着日粮中葡萄籽（单宁含量2.30%～4.60%）的增加，曲霉属相对丰度降低，而针对高粱的研究结果表明，2%～5%的高粱单宁可抑制霉菌的生长，说明曲霉属丰度变化与单宁含量增加有关。

4 结论

多浪羊瘤胃真菌的优势菌门为新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)和子囊菌门(Ascomycota)。真菌属相对丰度较高的菌属的优势菌为厌氧鞭菌属(Anaeromyces)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、未注释粪壳菌纲(unclassified_c__Sordariomycetes)、枝孢属(Cladospo⁃rium)、未注释肉坐菌目(unclassified_o__Hypocreales)、Vishniacozyma、支顶孢菌属(Acremonium)、未注释真菌(unclassified_k__Fungi)、阶菌属(Stephanonectria)、曲霉属(Aspergillus)。日粮中添加葡萄籽可增加瘤胃真菌菌群多样性，影响部分菌群相对丰度。