李高志，石菲，张舒，曹新生

空军军医大学航空航天医学系·航空航天医学教育部重点实验室，陕西西安710032

骨形成对于维持骨骼系统的完整性和功能性至关重要，骨形成障碍可导致多种骨骼疾病的发生，如骨质疏松症、骨不连等［1］。血管新生包括血管发生和血管形成两个过程。血管发生是指内皮祖细胞经募集、增殖、分化和迁移，形成功能尚不成熟的初级血管丛；血管形成是指从已存在的血管中生出新的血管［2］。在骨骼的生长发育及修复重建过程中，血管新生与骨形成有着紧密的时空联系。在时间上，血管新生早于骨形成，并且血管入侵是骨形成及矿化的前提条件；在空间上，新生血管为骨组织提供必需的氧气、营养物质和内分泌激素，而且能够清除代谢废物，同时作为骨与邻近组织联系的桥梁。血管新生与骨形成的这种紧密联系被称为“血管—成骨耦联”［3］。

近年，随着骨骼系统内H 型血管的发现，“血管—成骨耦联”的内在分子机制得到进一步拓展。研究表明，H 型血管是一种与骨形成密切相关的毛细血管亚型，H 型血管内皮细胞能够与多种骨骼细胞相互作用，从而实现血管新生与骨形成的耦联［4-6］。此外，H 型血管广泛参与骨质疏松症、骨关节炎等多种骨骼疾病的发生发展，并有望作为上述疾病的治疗靶点［7-8］。现将近年血管新生与骨形成耦联中及骨骼疾病发生及治疗中H型血管作用机制方面的文献进行综述。

1 骨内H型血管的特征

近年，RAMASAMY 等［5-6］根据内皮细胞的形态、表面标记物和功能特征将骨内微血管分为两种亚型：H型和L型。其中，H型血管（即CD31hiEmcnhi）高表达血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）和内皮黏蛋白（Emcn），主要位于干骺端和骨内膜，呈柱状排列，并在生长板附近通过血管环或血管弓相互连接。L 型血管（即CD31loEmcnlo）表达低水平的CD31和Emcn，主要分布于骨干的骨髓腔，呈高度分支的毛细血管网。在干骺端与骨干交界处，L 型与H 型血管相互连接，构成一个连续的血管床。此外，与L 型血管相比，H 型血管周围分布着大量的成骨谱系细胞。大部分Runt 相关转录因子2 阳性（Runx2+）的早期骨祖细胞、Osterix+骨祖细胞和I 型胶原阳性（Col1ɑ+）的成骨细胞与H 型血管直接相邻，血小板源性生长因子受体阳性（PDGFRβ+）的间充质细胞也选择性分布于H型血管周围。进一步的研究表明，H 型血管能够为骨代谢提供适宜的微环境，并通过旁分泌途径调节血管周围骨骼细胞的活性，使血管新生与骨形成相互耦联。

2 在血管新生与骨形成耦联中H型血管的作用机制

H 型血管新生与骨形成紧密耦联是通过H 型血管内皮细胞与多种骨骼细胞之间的相互调控实现的。其中，破骨前体细胞、成骨细胞和软骨细胞能够分泌细胞因子促进H 型血管形成［4，9-10］；同时，H 型血管内皮细胞也可以分泌细胞因子促进骨形成［5-6］。这种相互调控依赖多种信号分子及通路的参与，如缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、Notch 信号通路、血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）、SLIT3和γ-干扰素诱导型单核细胞因子（CXCL9）等。

2.1 通过HIF-1 信号通路参与血管新生与骨形成耦联 HIF-1是一种异源二聚体转录因子，由ɑ亚基和β 亚基组成，其中HIF-1ɑ 亚基是功能性亚基，决定HIF-1 的功能活性，并受到细胞内氧浓度的调节。在氧浓度>5%的富氧组织内，脯氨酰羟化酶（PHDs）和抑癌蛋白pVHL可以介导HIF-1ɑ蛋白通过泛素—蛋白酶体途径降解。在低氧状态下，HIF-1ɑ 不能被顺利降解，从而与HIF-1β结合形成HIF-1，后者作为转录因子，能够与基因序列中的低氧反应元件结合，反式激活下游靶基因，如血管内皮生长因子（VEGF）等，调节血管新生、组织修复等过程［11］。

近年研究表明，低氧信号通路在血管新生和骨形成的耦联过程中发挥关键调控作用。KUSUMBE等［6］发现，在内皮细胞特异性敲除HIF-1ɑ 的转基因小鼠中，可以观察到胫骨干骺端和骨内膜部位的H型血管显著减少，同时伴随着骨量减少和骨祖细胞数目降低。相反，在内皮细胞中特异性敲除Vhl 基因后，观察到H 型血管增多和新骨形成增强，并且Runx2+和Osterix+的骨祖细胞增多。此外，在给老龄小鼠补充外源性去铁胺甲磺酸（DFM）（PHD 抑制剂，能够增强HIF-1ɑ 活性）之后，小鼠表现为H 型血管增多和骨量增加［6］，而铁蓄积状态则会导致骨密度下降，同时骨内H 型血管的形成也受到显著抑制［12］。这些结果提示低氧信号通路在“血管—成骨耦联”过程中发挥重要作用。

2.2 通过Notch 信号通路参与血管新生与骨形成耦联 Notch信号通路是一条在进化中高度保守的、依赖细胞间直接接触的信号转导通路。目前，在哺乳动物中发现4种Notch受体（Notch1、2、3、4）和5种Notch 配体（Dll1、3、4 以及Jagged1、2）。当Notch 受体与配体结合后，其胞内结构域脱落并进入细胞核，调节下游靶基因的表达，调控血管新生等过程［13］。

在大部分组织中，如小鼠肾脏、胚胎和肿瘤组织，Notch信号通路能够通过限制内皮细胞出芽和增殖，负性调节血管新生［14］。然而，最近研究发现，在骨骼系统中，血管内皮细胞中的Notch 信号通路能够正性调节血管新生与骨形成［5，15-16］。在内皮细胞特异性敲除Notch 信号的转基因小鼠中，可以观察到胫骨组织内H型血管含量降低，柱状结构紊乱，血管内皮细胞的丝状伪足连续性中断；小鼠的股骨长度缩短，干骺端结构破坏，松质骨体积减少；转基因小鼠的生长板区域发生畸形，软骨细胞区扩大，能够促进软骨细胞分化的SOX9 表达降低，并且肥大软骨细胞产生的VEGF 显著减少。进一步研究发现，上述这些骨骼缺陷与内皮细胞分泌的Noggin 蛋白减少有关。在Notch 信号失活的转基因小鼠中补充外源性重组Noggin 蛋白，能够恢复干骺端的组织结构和骨祖细胞的数目，促进骨形成，同时恢复血管的完整性［5］。在此基础上，FU 等［15］发现，锌指转录因子ZEB1 在H 型血管中高度表达，其与CBP/p300 结合形成复合物，能够提高Dll4 和Notch1 基因启动子区的组蛋白乙酰化水平，从而激活Notch 信号通路，促进内皮细胞分泌多种细胞因子，如Noggin、转化生长因子-β（TGFβs）、骨形成蛋白（BMPs）等，进而促进骨形成。还有研究表明，非编码RNA 可通过调控Notch 信号通路影响骨骼的血管新生与骨形成。YANG等［17］发现，miR-497～195在H型内皮细胞中高度表达，并分别激活内皮细胞中Notch 和HIF-1 信号通路，正性调节血管新生与骨形成。上述这些结果提示，Notch信号通路及其上游信号分子在调控H型血管新生与骨形成的耦联过程中发挥重要作用。

2.3 通过PDGF-BB 参与血管新生与骨形成耦联PDGF-BB 属于PDGF 家族，其能够与内皮祖细胞和间充质干细胞表面的PDGFRβ结合，启动PI3K-AKT信号通路，调节其增殖、分化和迁移过程，从而调控血管新生与骨形成［18-19］。最近，XIE 等［9］发现，在骨形成和重建过程中，破骨前体细胞分泌的PDGF-BB能够诱导H 型血管形成，进而促进骨形成。GAO等［20］发现，巨噬细胞在骨形成过程中可以分化成为抗酒石酸磷酸酶阳性的单核细胞，并分泌PDGFBB，诱导骨膜来源细胞（PDC）表达周蛋白，同时募集PDC 至骨膜表面，促进皮质骨形成和H 型血管新生。PENG 等［21］研究表明，糖皮质激素能够抑制破骨前体细胞中NF-κB 信号通路，减少PDGF-BB 表达与分泌，导致H 型血管减少，造成骨形成速率降低、骨量减少。此外，还有研究发现，荷叶碱通过抑制MAPK 和NF-κB 信号通路，阻断单核的破骨前体细胞融合为多核的成熟破骨细胞，从而维持破骨前体细胞的数目，并促进其分泌PDGF-BB，最终增强H型血管新生与骨形成［22］。这些结果表明，破骨前体细胞分泌的PDGF-BB 是调控H 型血管新生与骨形成的重要信号分子。

2.4 通过SLIT3 参与血管新生与骨形成耦联SLIT3 是SLIT 蛋白家族的成员之一，其最初发现于中枢神经系统，是一种在进化上高度保守的分泌型糖蛋白，通过与靶细胞表面的跨膜受体ROBO（Roundabout）蛋白家族结合，调节神经元前体细胞的迁移和神经轴突的定向生长［23］。除此之外，SLIT3蛋白也在其他组织中表达，并参与调节血管新生等过程［24］。

近年研究表明，SLIT3 在“血管—成骨耦联”过程中发挥重要调控作用。XU 等［4］发现，在骨骼系统内，成骨细胞来源的SLIT3 通过与H 型血管内皮细胞表面的ROBO1 受体结合，诱导H 型血管新生，进而促进骨形成。随后通过建立骨折和绝经后骨质疏松的动物模型，进一步证实SLIT3 是调节H 型血管新生与骨形成的关键因子，并有望作为促进骨折愈合、治疗骨质疏松的新靶点。

2.5 通过CXCL9 参与血管新生与骨形成耦联CXCL9 是趋化因子CXC 家族的一员，通常与其受体CXCR3 结合，激活下游信号通路并发挥调节功能。最近，HUANG 等［25］发现，在骨形成和重建过程中，成骨细胞可以持续性分泌CXCL9，后者能够与VEGF相互结合，并阻止VEGF识别内皮细胞表面的受体，最终抑制H型血管新生与骨形成。

3 多种骨骼疾病发生及治疗中H型血管的作用机制

H 型血管在“血管-成骨耦联”中的重要作用日益引发临床医学工作者的关注。近年研究发现，H型血管在骨质疏松症、骨关节炎等多种骨骼疾病中表现出异常的形态特点，并参与上述骨骼疾病的发生发展。此外，H 型血管调控骨形成的相关信号分子及通路也为骨骼疾病的治疗提供了新的干预靶点。目前，针对H 型血管的靶向药物已经在多种动物模型中获得了积极的治疗效果，对于将来的临床应用有一定的借鉴意义。

3.1 骨质疏松症发生及治疗中H 型血管的作用机制 骨质疏松症是人类最常见的骨骼疾病，其主要特点是骨密度降低、骨微结构改变，同时骨骼脆性增强，使患者发生脆性骨折的风险升高。老龄和雌激素水平降低是骨质疏松症的主要危险因素。研究发现，老龄小鼠和去卵巢小鼠在发生骨质疏松的同时，骨内H 型血管内皮细胞、骨祖细胞和成骨细胞数目均显著减少［6，9］。同时，多项研究表明人类骨骼中也存在H 型血管，并且H 型血管的含量与骨密度具有正相关性。因此，H 型血管可以作为人类衰老和骨质丢失的生物标志物［7］。不仅如此，H 型血管的发现也为治疗骨质疏松提供了新的靶点。研究发现，在老龄和去卵巢小鼠中补充DFM 能够提高骨内H型血管的含量，促进胫骨和股骨的骨量增加，骨祖细胞的数目增多［6］。此外，在骨质疏松小鼠中补充一些小分子药物，如肉叶芸香碱和荷叶碱，能够促进破骨前体细胞表达PDGF-BB，从而诱导H 型血管新生，促进新骨形成［22］。另外，一些非编码RNA 的生物制剂，如aptamer-agomiR-195 和microRNA-136-3p Agomir，也能够显著缓解骨质疏松小鼠内H 型血管的减少与骨丢失［17］。

3.2 骨关节炎发生及治疗中H 型血管的作用机制 骨关节炎是常见的关节疾病，其病理特点主要包括进行性软骨退变、软骨下骨硬化、软骨下骨血管侵犯等。研究发现，在骨关节炎发生过程中，软骨下骨中的H 型血管含量增多，后者能够促进软骨下骨形成及重塑。此外，软骨细胞对软骨下H 型血管的正反馈调节进一步促进了骨关节炎的发展。研究发现，雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）在关节软骨细胞中的过度激活会促进其分泌VEGF，从而诱导软骨下骨中H 型血管的形成，而新生血管又会刺激软骨细胞表达VEGF，进一步导致软骨下骨中H 型血管形成，最终引起软骨下骨形成。因此，抑制软骨细胞中mTORC1的活性能够降低软骨下H型血管的含量，缓解骨关节炎的进展［8］。另外，一些小分子药物，如常山酮和青蒿琥酯，也能够抑制软骨下H型血管形成，减轻关节软骨退变和软骨下骨硬化。

3.3 肌腱端病发生及治疗中H 型血管作用机制肌腱端，又称为起止点，是肌腱、韧带或筋膜附着于骨骼的部位。肌腱端病的主要病理特点是纤维软骨退变、骨坏死和过度的血管新生。WANG 等采用3种肌腱端病动物模型开展研究，发现TGF-β 的过度激活是引起异常骨形成和血管新生的重要因素。高浓度的活性TGF-β 能够募集间充质干细胞，并引起H 型血管新生、纤维软骨钙化和骨骼重塑。此外，在小鼠模型中，通过注射TGF-β 的中和抗体来抑制TGF-β 的活性，能够减轻过度的血管形成并恢复异常的骨骼重塑。

3.4 异位骨化症发生及治疗中H 型血管的作用机制 异位骨化症是指在骨骼系统以外形成新生骨。研究发现，在异位骨化症的发生过程中，新生骨中H型血管含量增加，后者进一步引起新骨形成。TGFβ 的过度激活能够募集间充质干细胞，并引起H 型血管过度新生。此外，在异位骨化症的小鼠模型中，通过注射TGF-β 的中和抗体来抑制TGF-β 的活性，能够延缓异位骨化症的进展。另外，在异位骨化症小鼠模型的间充质干细胞中特异性敲除TGF-β 受体，同样能够抑制异位骨化症的进展。

3.5 骨缺损修复中H 型血管的作用机制 H 型血管与骨缺损的修复过程密切相关。形态学研究发现，在大鼠胫骨骨缺损修复的中晚期，H 型血管选择性地分布于生长区域的骨小梁周围，促进新骨形成与骨重建。另外，通过使用促进H 型血管形成的小分子药物，可显著改善动物的骨缺损修复过程，如在骨折小鼠中应用麦冬皂甙D 或重组SLIT3 蛋白，均能够显著提高小鼠骨折部位的H 型血管含量，加速骨折愈合［4］。此外，采用一些生物材料，如Ca-P-Mg支架和含有生物活性分子的超临界CO2泡沫复合支架，诱导大鼠颅骨骨缺损部位的H型血管形成，结果促进了颅骨的修复与再生。

综上所述，H 型血管是一种特殊的骨组织毛细血管亚型，能够与成骨细胞、破骨前体细胞、软骨细胞和骨祖细胞建立复杂的调控网络，使得血管新生与骨形成在骨骼发育及修复重建过程中实现相互耦联；其调控机制涉及HIF-1 信号通路、Notch 信号通路、PDGF-BB、SLIT3 和CXCL9 等多种细胞因子及信号通路。此外，H 型血管与骨质疏松症、骨关节炎等骨骼疾病的发生发展密切相关，其相应表现和作用机制已经得到初步阐明，针对H 型血管的靶向药物也在上述疾病的动物模型中获得了积极的治疗效果。未来，对H 型血管的深入研究将进一步加深对“血管—成骨耦联”分子机制的理解，并有望为骨骼疾病的诊治提供新的思路。