崔晓鸣，刘力，张博

1天津市儿童医院天津大学儿童医院检验科，天津 300074；2天津市儿童医院天津大学儿童医院风湿免疫科；3天津医科大学基础医学院免疫学系；4天津市细胞与分子免疫重点实验室

川崎病（Kawasaki disease，KD）是由日本学者Tomisaku Kawasaki首次报道发现的一种皮肤黏膜淋巴结综合征［1］。KD好发于5岁以下儿童，主要临床表现为急性发热、皮疹、黏膜血管炎、肝脾淋巴结肿大等［2］。KD被列为急性儿童血管性疾病，可导致儿童获得性心脏冠状动脉病变（Coronary artery lesion，CAL），主要包括冠状动脉扩张、冠状动脉瘤、冠状动脉狭窄、冠状动脉瘘形成等，症状严重者可出现心肌梗死及缺血性心肌病，甚至猝死。KD目前已经是发达、发展中国家儿童最常见的获得性心脏病的病因［3-4］。目前KD的治疗方法为早期大剂量静脉注射免疫球蛋白（Intravenous Immunoglobulin，IVIG）联合阿司匹林［5］。KD的病因目前尚不明确，具有感染、环境污染及过敏等多个假设［6］。早诊断、早期干预是KD治疗的关键，但目前临床尚缺少KD诊断的“金标准”。我们运用生物信息学方法分析川崎病（KD）患儿差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并观察KD患儿血清中相应DEGs蛋白的表达变化，现将结果报告如下：

1 资料与方法

1.1 KD患儿及健康儿童DEGs筛选

1.1.1 数据来源 KD基因测序数据来源于Yu Rang Park创建的KD数据库（Kawasaki Disease Database，KDD）［7］。作为首个公共数据库，KDD包括了亚洲范围内1 283例儿童病例的1 292个标本临床数据和相应基因组数据。

1.1.2 KD患儿及健康儿童DEGs筛选 通过R软件中edgeR软件包在纳入基因组中筛选KD患儿及健康儿童DEGs以对数转换的差异表达倍数（Log2FC）的绝对值＞1和P＜0.05为条件进行筛选［8］。绘制DEGs的火山图谱，一个点代表一个基因，红色点代表基因表达上调，绿色点代表基因表达下调，黑色小方块表示基因没有显著差异变化；横轴表示差异表达的倍数，纵轴表示-Log10（错误发现率）。

1.2 KD患儿及健康儿童外周血中基质金属蛋白酶8（MMP-8）、嗅介蛋白-4蛋白（OLFM4）蛋白水平检测

1.2.1 临床资料 选择我院2017年7月—2020年7月间收治的典型KD患儿40例。根据2017年美国心脏协会新版《科学声明》，具备以下6项临床表现中的至少5项：①持续发热≥5 d；②多形性皮疹；③口腔黏膜弥漫充血，杨莓舌，口唇充血皲裂；④急性非化脓性颈部淋巴结肿大，通常直径＞1.5 cm；⑤非渗出性双眼球结膜充血；⑥肢端变化，急性期掌趾红斑，手足硬性水肿，恢复期膜状脱皮。如果患者仅具备上述主要症状中的4项，但超声心动图或冠状动脉血管造影证实有CAA或扩张时，也可诊断为典型KD。根据此标准，最终入组40例。另选择15例健康儿童为对照，排除血液疾病、免疫系统疾病及感染性疾病者。本研究经本院伦理委员会批准同意，纳入者家属均知情同意。。

1.2.2 KD患儿及健康儿童外周血MMP-8、OLFM4蛋白水平检测 因“1.1”得到的DEGs中MMP-8、OLFM4基因差异最为明显，最终采用ELISA双抗体夹心法检测KD患儿及健康儿童外周血MMP-8、OLFM4，具体操作严格按照试剂盒说明书进行（试剂盒选自Abcam公司）。为了减少待测人群冻存后细胞数量和检测因子受损严重情况，影响指标检测，本项目样本采用新鲜提取的外周血，分批次对待测人群进行检验，最终的数据进行统一整理。标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100 mL，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液（PBS）50μL，混匀；以此类推，逐步稀释，最终稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为24、16、8、4和2μg/L；加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。进一步温育和洗涤。显色：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定。以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的光密度OD值。测定应在加终止液后15 min以内进行。实验独立重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用Excel 2013软件建立数据库，SAS 9.4和SPSS 19.0统计软件进行数据分析。对连续性变量进行正态分布检验，符合正态分布的变量以±s表示，采用SAS 9.4中的T test方法用于数据比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KD患儿及健康儿童DEGs筛选结果 与健康儿 童 相 比，KD患 儿 有MMP-8、OLFM4、OLAH、CD177、RETN、CEACAM8、LCN、LTF、ARG1以及HP基因等288个DEGs，其中表达上调186个、表达下调102个。在此其中，MMP-8和OLFM4差异最为明显（P均＜0.05）。

2.2 KD患儿及健康儿童外周血MMP-8、OLFM4表达蛋白水平比较 KD患儿外周血MMP-8、OLFM4表达水平分别为（73.21±13.66）、（26.37±5.88）ng/mL，健康儿童分别为（46.32±9.38）、（9.37±5.23）ng/mL，二者比较，P均＜0.05。

3 讨论

KD，是一种不明原因的急性自限性发热性疾病。目前关于KD的病因及发病机制尚不明确，包括肺炎支原体、化脓性链球菌、疱疹病毒、轮状病毒在内的多种感染均有可能引发此类疾病［9］。与此同时，近期发现遗传因素在KD形成中也可能发挥重要作用。一些研究［10］结果表明，KD存在某些易感性的遗传因素，其中包括：同卵双胞胎患KD的风险在13%左右；有KD病史的父母后代KD发生率增加，以及受影响患者的兄弟姐妹中KD的发生率增加。全基因组分析发现多个基因的多态性与KD发生和发展密切相关。在家族连锁和基因组关联研究中，不同基因和基因区域的多个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）已被证实，这其中包括：Caspase-3（CASP3）、肌醇1，4，5-三磷酸激酶c（ITPKC）、CD40、FCGR2a和b以及细胞淋巴激酶（BLK）［11，12］。许多与KD相关的SNPs在其他炎症性疾病如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、红斑性狼疮和系统性硬化症中也有发现。以上研究结果均证实炎症免疫反应在这些疾病的发生发展中可发挥重要作用。

尽早发现和及时干预是KD临床治疗的关键。未经及时治疗的KD患者发生冠状动脉病变的概率在25%左右，也是儿童获得性心脏病最常见的病因［13，14］。KD与自身免疫系统密切相关，但具体机制尚不清楚。迄今为止，尽管对细菌毒素、超级抗原、真菌有机体和病毒性病原体进行了许多研究，但还没有发现任何潜在的感染原因。然而，主流学派仍然坚持：未知的刺激引发了炎症级联反应，激活了免疫系统固有的和适应性的免疫应答，最终导致KD的发生。与此同时，KD最终形成还需要先天免疫系统通过检测病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）来激活［15］。

在KD的急性期，循环促炎性和调节性T细胞的数量似乎有所增加。研究表明，KD患者的组织和冠状动脉血管壁中产生IgA的浆细胞数量有显著的增加。本研究中也发现，Macrophages M1和T cells CD8两类细胞在KD患者组中存在显著差异性。Macrophages异常表达普遍发生于KD患者。巨噬细胞活化综合征（Macrophage activation syndrome，MAS）相关联的KD患者近年来也逐渐见诸报道［16，17］。T cells CD8与KD的研究尚未全面展开，值得进一步深入研究。IVIG是针对KD患者目前临床推荐的主要治疗方式。施用IVIG后，患者体内的调节性T细胞群和B细胞激活因子的正常化。所有上述发现都支持适应性免疫系统在KD中的重要作用。但具体那个免疫分子发挥更重要的作用，尚需进一步研究。

目前针对KD缺乏有效的临床标志物。本研究发现，MMP-8和OLFM4在KD患者存在显著性高表达，并且可以在临床检验中得到证实。MMP是一种锌依赖性明胶酶。MMP蛋白家族参与自身免疫功能调节，可以降低细胞外基质蛋白的表达进而影响免疫细胞的转移［18］。MMP-9（MMP家族中另一个重要蛋白成员）可以作为儿童严重脓毒症（一种免疫系统相关常见疾病）的潜在临床标志物［19，20］。在该研究中，与健康对照相比，严重脓毒症患者的血浆MMP-9水平在第1天显着升高。但是值得注意的是，成人脓毒症和儿童脓毒症患者中测量MMP-9的水平不尽相同。MMP-9在脓毒症和KD中的作用可能与其在基底膜中裂解胶原蛋白的功能密切相关有关。该过程可以促进白细胞和淋巴细胞能够进出外周循环。OLFM4是一种分泌型糖蛋白，标志着中性粒细胞的一个子集。

OLFM4异常表达证实与儿童脓毒症恶化相关［21］。基于一项单中心、前瞻性队列研究，OLFM4可能是儿童脓毒症预后不良的独立危险因素。OLFM4阳性的中性粒细胞百分比的增加与病死率相关。OLFM4阳性的升高（≥37.6%）的脓毒症患者中，56%死亡，而OLFM4阳性的＜37.6%的脓毒症患者病死率为18%。OLFM4阳性的与病死率之间的关联经得起年龄、性别、绝对中性粒细胞计数、合并症和疾病严重程度的标准测量（SOFA评分，APACHEⅢ）的调整。OLFM4阳性的中性粒细胞百分比与脓毒症的60天病死率独立相关，并且可能代表了宿主对脓毒症反应异质性的新衡量标准。一项以小鼠为动物模型的研究［22］发现，OLFM4基因缺失的小鼠可以显著的摆脱脓毒症影响。当在小鼠中诱导脓毒症时，OLFM4-null小鼠的存活率显着增加。脓毒症诱导后24 h的免疫组织化学表明肾脏中OLFM4的表达增加，其定位于Loop of Henle。与OLFM4-null小鼠相比，野生型小鼠的肾细胞凋亡和血浆肌酐显着增加。最后，骨髓移植表明肾脏中增加的OLFM4反映了局部产生而不是从血浆中过滤出来。以上研究证实MMP-8和OLFM4与儿童免疫系统疾病的发生和发展密切相关。

本项目从多角度全面比较了KD患者的差异性基因和特异性免疫细胞表达，并提出2个潜在的临床标志物。然而，本研究为单中心研究，样本量有限，尚存在一定的局限性。为了使这些标志物更有效的进行临床推广，未来还需要进行多中心、大样本量研究。

综上所述，KD患儿主要有MMP-8、OLFM4等288个DEGs。KD患儿外周血中MMP-8、OLFM4蛋白表达水平升高，存在显著性差异。MMP-8、OLFM4可能作为KD检测的潜在临床标志物。