苏青青,郦春蓉,王先云,张 东,黄 鑫

(1.上海大学环境与化学工程学院,上海200444;2.城市水资源开发利用(南方)国家工程研究中心,上海200082)

随着经济发展和排污工作的展开,城市水源地的富营养化问题日益突出.如果不重视预警监测,那么后期可能会面临藻类爆发风险[1-2].因此,水中藻的快速定量成为一个重要命题.传统的藻定量方法包括藻颗粒计数法、以叶绿素chla为代表的色素定量法、干重法等[3-4].传统的藻颗粒计数法将水中藻打散后对单藻进行计数,工作量大,计数误差也较大.叶绿素a法和干重法无法实现连续测定;直接荧光探头法和库尔特细胞计数法测定简单,适宜监测,但易受其他因素如浑浊度、水质等影响;流式细胞计数显微计数法[5]在监测藻团密度和大小分布方面准确性较高,但无法对水中庞杂的藻种进行分类.

在自然水体中,数量占优的藻种往往容易聚集成藻团[6].在局部水域迁移聚集过程中,粒径较大的藻团易于在水体表层聚集[7-8].受风的影响,漂浮于水体表面的藻易积聚成带团状聚集体,沿下风向运动迁移,从而形成水华[9].从供水角度出发,水中不同大小、形态特征各异的颗粒物与自来水厂的净化效率有直接的联系.颗粒大小是影响水处理工艺效率的关键因素,由于水体中藻类颗粒的大小大多在2～200µm,极少数小于2µm,因此含藻原水进入水厂后水质将恶化,干扰水处理,具体表现为滤料层堵塞、老化池壁及致臭等.利用计算机图形图像算法,快速检测水中聚集成团藻的形态学特征值,能在现有藻密度、种属检测基础上形成新的数据,为水中藻形态的自动快速测定提供前期研究,为水库及下游水厂的藻类防控工作提供技术支持.本工作于2015年3～7月对华东某水源水库进行采样,通过显微镜检测水中藻种,获取清晰图像照片,并定量水中团簇藻团的2维投影特征值,进而开展数据相关性分析,以及利用特征值统计学算法进行藻的定量分析.

1 材料与方法

1.1 采样点设置

图1为华东某水源采样点分布图.该水源水库水量丰富、水质优良,是该地区供水的战略储备.但其库容较大,水体流速相对缓慢,藻类容易增殖.该水库地处长江口,水质受到上游长江来水和人类活动的影响.监测表明,该水库总磷平均质量浓度为0.10 mg/L,最高为0.15 mg/L,总氮平均质量浓度为1.80 mg/L,最高为2.00 mg/L[10].考虑该水源水库的水文、地形和供水区域等因素,在库区设置6个监测点,各监测点分布如图1所示.图中1#、2#为库尾站点;3#为库中站点;4#为垦区站点;5#为库首站点.

1.2 样品采集与分析

2015年3～7月,该水库为人工水库,水深3～8 m.为减小采样误差,现场采用多层采样方法,同一取样点采集表层(0.5 m)、中层(3.0～5.0 m)和底层(沉积物以上0.5 m)水样进行混合,后期频率为每月一次;水样采集后立即用鲁哥式碘液固定(10 mL碘液加入到1 000 mL水样中),固定后的水样静置沉淀24～36 h;充分沉淀后取底部沉淀和上浮边壁藻浓缩液20～25 mL,加入质量分数为3%的福尔马林溶液保存并尽快测定.上述过程参照《水和废水监测分析方法(第四版)》和《湖泊富营养化调查规范(第二版)》.

1.3 数据采集和处理

将浓缩沉淀后的水样充分摇匀后,光学显微镜(LAO-1100B,上海)下开展藻类形态学观察,依据《中国常见淡水藻志》[11]对每个藻种进行辨别鉴定至属或种水平,统计藻种数量.每个样品重复计数3次,取平均值.同时通过与显微镜连接的数码摄像头进行图像采集,分辨率为2 592(H)×1 944(V).图像后期处理经Image-Pro Plus 6.0软件测定面积、圆度、长短轴等8种2维平面形态学指标.所有指标的统计分析在R语言平台实现,利用Rpart包实现分类回归树(classification and regression tree,CART)方法构建优势藻种识别模型.

图1 华东某水源水库采样点分布Fig.1 Distribution of sampling sites in a water source reservoir of East China

2 结果与分析

2.1 优势藻种分析

2015年3～7月藻种分布的演替规律明显(见图2).在门水平上,3、4月份黄藻门占据绝对优势,占总藻密度的78.9%～92.6%,对应的藻密度在1.59×106～7.03×107cell/L之间;5月份气温上升,黄藻门数量急剧减少,同时绿藻门、隐藻门比例有所增大,黄藻门仍占据相对优势;6、7月份绿藻门及硅藻门占据优势,蓝藻数量随时间推移有一定增加.具体到种属层面,3、4月份黄丝藻占总藻密度比例超过90%;5月份开始急剧减少;6月份达到最低值后,7月份又略有增加.期间,硅藻门中的小环藻、冠盘藻在5月份后数量有较明显的增加.而该年度秋冬季(9月份之后),硅藻门的小环藻成为优势藻种(数据未列出).藻种分布变化的原因显然受气温影响较大,黄丝藻呈现春季多夏季少的特点,原因是春季水温适宜,适合黄藻门的黄丝藻生长;但夏季光照充足,水温相对较高,对黄丝藻生长不利,这与文献[12]中黄丝藻适宜低温生长的结论一致.

2.2 主要藻种的藻团形态学特征

2015年2～12月间,除少数难以鉴定的藻种外,本工作共计辨识出93种藻种,累计处理图形对象5 952个,其中出现频次最高的是黄藻门的黄丝藻,其次是硅藻门的小环藻.考虑到藻种种类繁多,本工作选取前20种出现频次不小于10的藻种(图3中自上而下排列)作为主要藻种,考察其面积、圆度、长径、长短径比值等形态特征(见图3).

图3中,不同藻种4种参数相差显著.面积上,黄丝藻和伪鱼腥藻的藻团面积分别为(555.0±397.0)µm2和(318.0±293.0)µm2,面积平均值大,说明藻种自身体型较大;而小的藻种如小环藻仅为(55.2±54.4)µm2,是黄丝藻的六分之一,伪鱼腥藻的十分之一左右(见图(a)).藻团2维投影的长径数据也表明黄丝藻和伪鱼腥藻显著高于其他藻类(见图(b));藻团长短径比值上,除黄丝藻和伪鱼腥藻,其余藻团的长短径的比值都小于3,而黄丝藻和伪鱼腥藻分别达到7和30左右(见图(c)).黄丝藻和伪鱼腥藻的圆度值也较高.图4为黄丝藻、小环藻和伪鱼腥藻的显微镜检图,从图中可以直观地看出三者自身形态及藻团面积的明显差异.

图2 2015年3～7月藻种分布Fig.2 Distribution of algal species from March to July 2015

图3 主要藻种的形态参数分布特征对比Fig.3 Comparisons of morphological parameter distribution characteristics of main algal species

图4 主要藻种的显微镜检图Fig.4 Microscopic pictures of main algal species

2.3 藻团2维投影形态特征值的应用

优势藻种中的黄丝藻为长链型丝状藻,藻团体形狭长,形态学特征与其他藻种的藻团差异明显.理论上,藻团投影面积侧面反映了藻种数量的多少.在藻数量增加的同时,藻团投影面积也必然增大.如有学者建立微囊藻群体投影面积与细胞数之间的回归方程,以估算藻细胞数[13].但是否在实际水样中适用,还需要进一步检验.

选取水中的优势藻种,包括出现频次较高的小环藻、黄丝藻,以及形态学上有显著不同的伪鱼腥藻.对每个水样中3种藻的藻团投影面积与藻团密度展开相关性分析(见图5),其他藻类全部归在第4类中.图5中,只有黄丝藻的密度和投影面积呈现较高的相关性(R2=0.712),而藻的总密度和总面积之间的相关性不高(R2=0.430,数据未作图).显然由于藻种种类繁多(显微镜检下能辨识的多达93种),形状规则程度不同(见图3),因此与文献中的结论并不完全一致[14].而对单一藻种,如因密度大而为优势藻的黄丝藻,其藻团狭长、投影面积大,具有较好的辨识度,因此与藻密度具有较好的相关性.进一步地,二者的关联随时间变化呈现基本同步的特征(见图(a)),3、4月份藻密度和藻团面积均最大,此后逐步降低.这与温度升高后,水库中优势藻种更替有关.5月开始蓝藻、硅藻增多,8月后优势藻不再是黄丝藻.由此可见,形态学特征显著是显微镜自动辨识的基本要求.藻团2维投影面积定量藻种密度具有不确定性,作为单一指标不够精确,故需要引入藻团形态特征等其他参数以进一步提升辨识精度.

图5 黄丝藻、小环藻和伪鱼腥藻藻种投影面积与藻种密度的相关性Fig.5 Correlation between the projected area and algal species density of Tribonema,cyclotella and Pseudoanabaena

进一步参照文献[15-17]中的参数选取,考察面积、圆度、长短轴比等2维平面形态学指标,作为优势藻种鉴别参数的可行性.于2015年2月～2016年8月(为期18个月),水库内的所有点位水样显微镜检测藻团对象共计9 438个,按照小环藻、黄丝藻、伪鱼腥藻和其他4种分类对象进行分类(见图6).选择黄丝藻和小环藻是因为调研中出现的频次较高,而考虑到夏季伪鱼腥藻疑似为水中2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol,2-MIB)的来源藻种[18],且是大型丝状藻种,藻团面积较大,因此在上述2种优势藻种外加入伪鱼腥藻,其余藻种一律归为“其他”类别.最终,将9 438个藻团对象分成4类,作为因变量y.将长径、短径、长短径比、圆度、面积等形态学参数作为输入数据,同时考虑时间也是主观判断的一个重要因素,故月份数据也作为输入变量之一,上述数据为自变量x.构建通过X(自变量)计算得到Y(因变量,藻种类别)的分类回归树.

从分类效果看(见图6),黄丝藻、伪鱼腥藻和小环藻3个藻种显微图片的总体加权分辨率分别达到83%、86%和68%,其中前二者的辨识率较高,与黄丝藻和伪鱼腥藻藻团面积大、形状狭长、容易辨认有关.因此,基于藻团轮廓的形态学特征可达到部分辨识优势藻团目的,提供包括藻团面积、粒径、形状及上述参数时空分布的有用信息.

图6 优势藻种显微图的分辨效果(2015年2月～2016年8月)Fig.6 Resolution effect of microscopic pictures of dominant algal species(February 2015～August 2016)

本工作基于颗粒物大小对水厂水处理的影响,着重解决水中藻团粒径分布的快速检测.本工作重点不是藻的分类,而是快速检测出优势藻种,为2维投影作为藻的图形图像学特征提供基础数据,为水中藻形态的自动快速测定提供前期研究,最终化繁为简,实现藻种辨识和统计分析目标.图4中藻细胞的轮廓大小清晰可见,甚至部分大型藻细胞的内部细节也可看到.但不可否认,清晰的图像能够提供更多的细节,从而为后期的模型提供更多的图像特征值.例如,通过对比度的阈值设置,提取有内部气泡的藻类,或通过藻细胞体内色素的荧光特性,获取荧光特征值,从而提升模型准确度[19-22].靳雪莱等[23]建立了基于荧光比值特征和多元线性回归的识别方法,其实地采集样品的误差仅为10.86%.

不仅仅是监测仪器的升级,模型测试集和训练集的合理划分、藻细胞特征值的挖掘等也都是未来亟待研究的内容.值得注意的是,实际研究中需要动态监测1 mL水样中数以万计的藻类.如何在图像准确度与快速测定之间取得平衡,也是研究中需要考虑的.

3 结论

(1)2015年3～7月开展某水源水库优势藻种显微图像数字化分析.出现频次最高的是黄藻门的黄丝藻,其次是硅藻门的小环藻和冠盘藻.

(2)通过图形图像数字化分析,得到藻团2维投影面积.其中优势藻种黄丝藻的投影面积和藻密度呈现较高的相关性(R2=0.712),而其他藻种的相关性均较小.因为黄丝藻为长链型丝状藻,藻团体形狭长,所以其2维投影的面积、长径及长短径比值等显著高于其他藻种,形态学特征明显.

(3)采用分类回归树方法开展2015年3～12月期间原水样品中黄丝藻、小环藻和伪鱼腥藻3种典型藻种的统计回归分类,分辨效果良好,分辨率分别达83%、68%和86%.

(4)藻团2维投影特征度量方法结合图像识别技术,可提供藻团面积、粒径、形状参数及这些参数的时空分布,同时辨识优势藻团.后续将获取更多图像特征值结合算法优化,有望实现水中藻团的快速识别与特征测量.