王倩 ，兰天翔 ，叶碧波 ，蒲仕明 ，吴琼

1 广西师范大学生命科学学院，广西桂林541006；2 广西高校干细胞与医药生物技术重点实验室广西师范大学

研究表明，无论在正常还是病理状态下，成体心肌组织中均存在具有特异性心肌分化潜能的多能干细胞，即心脏内皮祖细胞，其在维持心脏稳态和再生中起着关键作用［1］。在心脏中存在的心脏内皮祖细胞可以在损伤的情况下分化为心肌细胞，从而提高损伤心脏的修复能力［2］。心脏来源的Sca-1+细胞具有心脏内皮祖细胞特征，即体外长期繁殖能力、体内非致瘤性、干细胞和心脏特异性标志物的持续表达以及向心肌细胞谱系的多能分化［3］。本课题组前期研究发现，小鼠Sca-1+心脏内皮祖细胞可分为Lin-CD45-Sca-1+CD31+和Lin-CD45-Sca-1+CD31-两个亚群细胞，Lin-CD45-Sca-1+CD31+细胞占总细胞的比例明显多于Lin-CD45-Sca-1+CD31-细胞，但不具有分化与自我更新能力，而Lin-CD45-Sca-1+CD31-细胞具有分化与自我更新的能力。microRNA和mRNA表达的综合分析表明，20 个 microRNA 和 49 个 mRNA 与 Sca-1+CD31-和Sca-1+CD31+亚型细胞干性特征呈负相关［4］。其中，mmu-miR-322-5p具有更多靶向和反向相关的基因和转录因子，并且可能具有更高的心脏内皮祖细胞分化潜力［4］。2018年6月—2019年8月，本研究探讨了miR322-5p 对小鼠Sca-1+心脏内皮祖细胞凋亡以及分化的影响，期望可以为心血管疾病治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 选择60 只C57BL/6 品系小鼠（2～3 月龄雌鼠），购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［SCXK（湘）2011-0003］。流式细胞分析仪（FACS Verse，美国Becton Dickinson公司）；流式细胞分选仪（FACS Aria Ⅱ，美国Becton Dickinson 公司）；多用途台式高速冷冻离心机（LABOFUGE 400R，美国Ther⁃mo Fisher Scientific 公司）；37 ℃ CO2培养箱（HERA⁃cell240i，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；荧光定量PCR 仪（LightCycler®96，Roche公司）；梯度PCR 仪（621BR07088）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心脏单细胞分离 颈椎脱臼法处死小鼠，浸泡于75%乙醇中15 s，用手术剪剪开小鼠胸腔皮肤，将胸腔打开，快速取出心脏并放入盛有肝素钠-PBS（1∶9）溶液的培养皿中。在超净工作台中将心脏转移到盛有预冷的PBS 的培养皿中，用镊子挤压心脏除去血块，再用手术剪将心脏纵向剖开。用预冷的PBS 冲洗心脏组织3～4 次，至PBS 溶液清澈。将心脏转移至紫色的C 管，加入胶原酶Ⅱ，将C 管置于组织处理器的一个通道上，使用加热模块将组织解离体系加热至37 ℃，运行已设置好的程序。消化结束后加入等体积的培养基终止消化，用40µm 细胞筛网过滤至 15 mL 离心管中，4 ℃、1 600 r/min 离心5 min，去除上清，加入PBS，重悬细胞。

1.2.2 Sca-1+心脏内皮祖细胞的丰度分析及分选 取1 mL心脏单细胞悬液置于做好标记的1.5 mL EP管中，微量离心机1 600 r/min离心5 min，去上清。每管分别加入100 µL 稀释100 倍的Anti-Mouse CD45 FITC、Anti-Mouse Ly-6A/E（Sca-1）PE-Cy7、Anti-Mouse CD31（PECAM-1）APC 以及这 3 种抗体的组合混合液，4 ℃避光孵育30 min。孵育结束后，加入适量PBS 重悬，离心5 min，去上清，再加入1 mL PBS 重悬。使用BD FACS Aria Ⅱ流式分选仪无菌分析Sca-1+心脏内皮祖细胞亚群的丰度并分选CD45-Sca-1+CD31+与CD45-Sca-1+CD31-心脏内皮祖细胞。

1.2.3 Sca-1+心脏内皮祖细胞培养 将分选得到的CD45-Sca-1+CD31+细胞与CD45-Sca-1+CD31-细胞用微量离心机1 800 r/min 离心5 min，去上清，用含10%Gibco®澳洲胎牛血清、1%青链霉素混合液和89%Gibco®DMEM/F-12（1∶1）basic（1×）的完全培养基重悬。按每孔1×104细胞接种于经多聚赖氨酸包被的96 孔板中，置于37 ℃CO2培养箱培养。24 h后，吸去培养基，每孔加入100µL 生长培养基培养，每隔3 d 换液，待细胞密度达到50%左右进行慢病毒转染。

1.2.4 慢病毒转染 本实验使用的慢病毒（HBLVGFP-PURO 标记空病毒液、HBLV-m-mmu-miR322-5p-sponge-GFP-PURO 标记敲低病毒液、HBLV-mmmu-mir322-GFP-PURO标记过表达病毒液）由上海汉恒生物提供。病毒存放于-80 ℃冰箱，使用前置于冰上解冻待用。配制Polybrene 工作液：将Poly⁃brene 加入到生长培养基中，使终浓度为5 µg/mL。将1.2.3 中的96 孔板取出，吸去培养基，每孔加入50 µL 预热的 Polybrene 工作液，放入 37 ℃ CO2培养箱孵育30 min。孵育结束后取出96 孔板，以感染复数=50 加入相应体积的病毒液，放入37 ℃CO2培养箱中培养，12 h 后向每孔补充适量培养基使总体积达到100µL，放入37 ℃CO2培养箱继续培养。转染24 h后，吸走含有病毒液的培养基，每孔加入100µL生长培养基继续培养。转染36 h 后，利用荧光倒置显微镜检测GFP 荧光信号，以对照为1，了解转染情况。转染72 h 后换液，继续培养。用胰蛋白酶消化细胞，TRIzol 法提取总RNA，用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）逆转录成 cDNA 后，realtime PCR 测定慢病毒敲低和过表达CD45-Sca-1+CD31+和CD45-Sca-1+CD31-两个亚群细胞的效率。利用特定的分化培养基诱导转染后的细胞分化，通过荧光倒置显微镜检测分化情况。

1.2.5 miR322-5p 表达检测 从37 ℃CO2培养箱取出1.2.4 中转染好的细胞，吸去培养基，用胰蛋白酶消化细胞，离心弃上清得到细胞沉淀，每管加入1 mL TRIzol Reagent，吹打混匀。加入 200 µL 三氯甲烷，小心盖好管盖，用力振荡，室温静置5 min。4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。取上清至新的EP 管，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置20 min。4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。弃上清，加入1 mL的75%乙醇，上下颠倒清洗，4 ℃、12 000 r/min离心2 min，弃上清。室温静置2～5 min，加入10 µL RNase-free 水，轻轻吹打混匀，使RNA 充分溶解。按Mir-X ™ miRNA First-Strand Synthesis and SYBR®qRT-PCR User Manual 说明书（www.clontech.com）方法逆转录成cDNA并进行real-time PCR检测。

1.2.6 细胞凋亡检测 配制1×Binding Buffer：取1 mL 10×Binding Buffer，加 9 mL ddH2O 稀释。从37 ℃CO2培养箱取出1.2.4中转染好的细胞，吸去培养基，加入胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移到标记好的2 mL EP管中，用微量离心机1 600 r/min离心5 min，去上清，加入1 mL PBS 重悬。离心去上清后，每管加入0.5 mL 1×Binding Buffer 润洗1 次。离心去上清，每管加入100 µL 1×Binding Buffer 重悬细胞，再加入5µL Annexin V，室温条件下避光孵育15 min。孵育结束后加入0.5 mL 1×Binding Buffer 混匀，离心去上清。加入100 µL 1×Binding Buffer 重悬细胞，再加入5µL 7-AAD，4 ℃冰箱避光孵育5 min。孵育结束后每个样品管加入0.5 mL PBS 重悬细胞，4 h 内进行流式检测。

1.2.7 细胞分化情况观察 从37 ℃CO2培养箱中取出1.2.4 中转染好的细胞，吸去培养基，用特定的分化培养基诱导其分化形成心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞。诱导14 d 后，吸去培养基，加入PBS，洗2～3 次。吸去PBS，加入50 µL 多聚甲醛，在摇床上固定15 min。吸去固定液，用PBS 洗2～3次。弃上清，加入50 µL 1% Triton X-100 通透细胞10 min。吸走 Triton X-100，用 PBS 洗 2～3 次。加入50µL 1%BSA，封闭30 min。吸走封闭液，加入50µL用1% BSA 稀释好的对应一抗［Anti-Cardiac Tropo⁃ninⅠ antibody、Anti-alpha smooth muscle Action anti⁃body（EPR5368）、Anti-Von Willebrand Factor anti⁃body］，4 ℃冰箱过夜孵育。第2 天从冰箱取出96 孔板，吸掉一抗，PBS 洗 2～5 次。小心吸走 PBS，加入50 µL 用1%BSA 稀释好的对应二抗［Goat Anti-Rab⁃bit IgG H ＆ L（DyLight®550）preadsorbed antibody］，37 ℃避光孵育1 h。吸去二抗，PBS 洗2 次。吸去PBS，加入50µL的15µg/mL DAPI，在摇床上避光慢速孵育5 min。吸去DAPI细胞核染色液，PBS 洗2～3次。吸去PBS，加入1～2 滴抗荧光淬灭封片液封片。在荧光显微镜下观察细胞分化情况。

1.2.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-心脏细 胞 丰 度 CD45-Sca-1+CD31+ 、CD45-Sca-1+CD31-细胞占总细胞的比例分别为（3.53±0.47）%、（0.61±0.11）%，两者相比P<0.01。

2.2 miR322-5p在CD45-Sca-1+CD31+与CD45-Sca-1+CD31-细胞中的表达比较 miR322-5p 在CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-细胞中的相对表达量分别为1.00 ± 0.03、0.04 ± 0.00，两者比较P<0.01。

2.3 CD45-Sca-1+细胞miR322-5p基因修饰效果在miR322-5p 基因敲低的CD45-Sca-1+CD31+细胞中，miR322-5p 相对表达量（0.09 ± 0.02）减少，P<0.001；在miR322-5p 基因过表达的CD45-Sca-1+CD31-细胞中，miR322-5p 相对表达量（19.33 ±4.52）增多，P<0.01。

2.4 miR322-5p对小鼠CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-心脏内皮祖细胞存活的影响 细胞凋亡检测结果显示：与CD45-Sca-1+CD31+细胞凋亡率（0.760 ± 0.114）相比，miR322-5p 基因被敲低的CD45-Sca-1+CD31+细胞凋亡率（0.556 ± 0.116）降低（P<0.05）。与 CD45-Sca-1+CD31-细胞凋亡率（0.830 ± 0.013）相比，miR322-5P 基因过表达的CD45-Sca-1+CD31-细胞凋亡率（0.903 ± 0.017）升高（P<0.05）。

2.5 miR322-5p对小鼠CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-心脏内皮祖细胞分化的影响 免疫荧光染色结果显示，在CD45-Sca-1+CD31+细胞中敲低miR322-5P 基因后，细胞分化为心肌细胞、平滑肌细胞的能力无明显变化，分化为血管内皮细胞的能力增强；在CD45-Sca-1+CD31-细胞中过表达miR322-5p 基因后，其分化为心肌细胞的能力增强，分化为平滑肌细胞的能力无明显变化，分化为血管内皮细胞的能力降低。

3 讨论

心脏Sca-1+细胞在梗死后心肌中的移植促使毛细血管的密度增加，将此细胞移植到心肌可减轻心肌损伤后不良的心脏重塑［5-6］。心脏Sca-1+细胞还指导心脏炎症过程中渗透到心脏的免疫细胞的类型，并驱动心力衰竭的发展［7］。天然存在的micorRNA 是21～25 个核苷酸的内源性非编码小 RNA 分子［8］，其从不产生蛋白质或氨基酸链，但在转录、转录后和翻译水平的细胞过程期间调节蛋白质表达［9］。microRNA存在于细胞外囊泡包装的体液中，从而使其非常稳定［10］。近年来的研究表明，microRNA 可影响多种生物学过程，包括发育、细胞分化、增殖和凋亡［11］；mi⁃croRNA 还与多种疾病进程相关联，例如癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等［12-14］。microRNA 干扰靶mRNA 的翻译并控制多种生理和病理过程［15］，还可微调整个信号网络的激活，从而调节复杂的细胞反应［16］。

miR-322是人miR-424的啮齿动物同源物，可参与调节细胞分化、增殖、凋亡以及不同组织和器官的代谢活动，是各种生物过程中至关重要的调节剂［17］。在小鼠中，miR-322（啮齿类 miR-424 直系同源物）的过度表达引起纤维萎缩，并减少上游结合转录因子的表达和核糖体 RNA 水平［18］。YANG 等［19］通过体外缺氧诱导小鼠心肌细胞实验发现，缺氧诱导后的小鼠心肌细胞凋亡增加，同时miR-322 显著上调，下调miR-322 的表达可有效保护缺氧诱导的心肌细胞凋亡。miR-322 可直接或间接上调许多与通路有关的基因，从而改善脂肪酸代谢并改善线粒体呼吸能力，这可能有助于减弱脂肪酸毒性和氧化应激，在心脏重塑的病理生理中起着重要作用［20］。

急性心肌梗死后，用于心肌再生的心脏Sca-1+心脏细胞治疗由于细胞生存力不足和高细胞凋亡率而受到限制［21］。本研究结果表明，miR322-5p 基因被敲低后，Sca-1+CD31+心脏内皮祖细胞的凋亡率降低，分化为心肌细胞、平滑肌细胞的能力无明显差异，分化为血管内皮细胞的能力增强；miR322-5p 基因过表达后，Sca-1+CD31-心脏内皮祖细胞的凋亡率增加，其分化为心肌细胞的能力增强，分化为平滑肌细胞的能力无明显差异，但分化为血管内皮细胞的能力降低。由此推测miR322-5P 基因很可能是调控CD45-Sca-1+CD31+与CD45-Sca-1+CD31-心脏内皮祖细胞凋亡与分化的一个关键因子。