宋 霞,刘亚蓉,张国英,张春平,常 炜,凌 云

(青海省药品检验检测院,青海省中藏药现代化研究重点实验室,青海 西宁 810016)

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉,具有补益肝肾、收涩固脱的功效。秋末冬初果皮变红时采收果实,用文火烘或置沸水中略烫后,及时除去果核,干燥[1]。山茱萸饮片分为山萸肉和酒萸肉2 种,其中山萸肉的炮制方法为除去杂质和残留果核,性状与山茱萸药材相同。随着山茱萸被临床广泛使用,种植面积不断扩大,主要产地有河南栾川、嵩县、西峡,陕西佛坪、周至,浙江临安、淳安,以及山西沁县等地。种植地域不同、气候条件不同,所产山茱萸药材品质有很大差异；加之许多栽培品种的出现,造成了市场上山茱萸药材品质不一。

本研究建立了山萸肉的性状等级划分方法,经稳定性试验发现山萸肉的表面颜色随着饮片储存年限的增长,逐渐加深,由紫红色变为黑色,且表面逐渐失去光泽,即山萸肉表面颜色愈深饮片年限愈长,品质越差；性状研究过程中发现156 批山萸肉饮片中23 批表面具有一层厚厚的白色物质(在性状鉴别时,难以直观判断出白色物质是白霜还是发霉产生的白毛,外观基本一致),且样品表面颜色均为紫黑色至黑色(应为陈货),其中20 批鉴定为白霜,3 批鉴定为发霉长出的白毛。经查阅文献,山萸肉、红枣贮藏过久,极易发霉变质,尤其是红枣含有大量糖分,干燥不彻底,更易发霉[2]。发霉是中药保管过程中吸潮所致,而与发霉现象表面较类似的泛霜现象原因有所不同,故应对2 种现象加以识别[3-7]。有关中药材泛霜和发霉的研究文献较少[8-9],中药材泛霜的化学成分和发霉霉菌种类鉴定均未见报道。查询到较多文献为山茱萸化学成分研究[10-13]。本研究建立了山萸肉表面泛霜和发霉的鉴别方法,白霜经测定成分主要为果糖、葡萄糖和蔗糖,发霉产生的白毛经DNA 测序鉴定为双孢旱霉,一种极其罕见的耐旱丝状真菌,且表面泛霜或发霉的山萸肉颜色均较深,表明泛霜和发霉的山萸肉为存储时间较长的陈货。

1 材料

Triple Quad 5500 液质联用仪(美国AB SCIEX公司)；LC-2030C 3D 高效液相色谱仪(ELSD-LTⅡ检测器,日本岛津公司)；BX53 生物显微镜、SZX16 体视显微镜 (日 本 Olympus 公 司)；BSA224S-CW 电子天平 (德国Sartrious 公司)；XS105DU 电子天平 (上海梅特勒-托利多有限公司)。

实验样品为2019 年国家药品评价性抽验品种山茱萸(包括山萸肉和酒萸肉2 种饮片),经青海省药品检验检测院刘亚蓉主任药师鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉,其中山萸肉饮片156 批。山茱萸对照药材(批号121495-200401)、D-无水葡萄糖对照品(批号 110833-201506)、果糖对照品 (批号100231-201305)、蔗糖对照品 (批号 111507-201303) 均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 山萸肉性状研究 本研究建立了山萸肉的性状等级划分方法,按照饮片颜色、大小、光泽、杂质进行等级划分,共划分4 个等级。从1 级到4级,山萸肉逐渐变小,颜色从紫红色到紫黑色或黑色,光泽从有到无,杂质从少到多。经稳定性试验,山萸肉的颜色随着存放时间的加长逐渐加深,从紫红色逐渐过渡到紫黑色或黑色。经对156 批山萸肉进行性状鉴别划分,一等品12 批,占总量的7.7%；二等品34 批,占总量的21.8%；三等品59 批,占总量的37.8%；四等品51 批,占总量的32.7%。山萸肉等级划规则分见表1,性状见图1。

表1 山萸肉性状等级划分规则Tab.1 Grading rules for characteristics of C.officinalis

图1 山萸肉性状（4 个等级）Fig.1 Characteristics of C.officinalis （four levels）

对156 批山萸肉饮片性状进行研究发现,23 批样品表面有一层白色物质。山萸肉饮片表面泛霜和发霉,在性状鉴别时难以直观判断出白色物质是白霜还是发霉产生的白毛,外观基本一致,见图2。

图2 山萸肉表面泛霜和发霉Fig.2 White frost and mold on the surface of C.officinalis

2.2 山萸肉表面白霜研究 有书籍记载山萸肉有掺白矾现象,性状与正品类似,唯表面明显有白霜状物[14],经铝盐的相关理化实验研究证明,该白霜并非白矾。还有文献报道,果实类经过长时间储存表面会生出一层白霜,为糖类成分。对白霜首先进行了糖的理化实验,结果呈阳性,再在体视显微镜和生物显微镜下进行研究,接着在液质联用仪上进行糖的种类验证[15-18],最后使用HPLC-ELSD 和氨基柱进行色谱峰分离,并与标准品比对,经证实山萸肉表面的白霜成分主要为果糖、葡萄糖和蔗糖。

2.2.1 糖的理化反应(α-萘酚反应) 称取未经任何处理的山萸肉2 g 置于试管中,加入超纯水10 mL,振摇试管5 下,使表面白色物质溶解于超纯水,立即过滤,滤液倒入另一试管中,作为供试品溶液。以超纯水为空白,在空白溶液和样品溶液中分别加入2 滴Molisch 试剂,充分混合,斜执试管,沿壁慢慢加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。浓硫酸在试液下形成2 层。供试品溶液的试管中,在二液分界处有紫红色环出现,表明α-萘酚反应呈阳性反应,试液中含糖,结果见图3。

图3 山萸肉表面白霜的糖反应（阳性）Fig.3 Sugar reactions of white frost on the surface of C.officinalis （positive）

2.2.2 体视显微镜下观察白霜 将表面有白色物质的山萸肉样品置于体视显微镜下观察,可见大量白色晶体。将表面有白霜的山萸肉在水中润湿一下,立即取出,自然晾干,再置体视显微镜下观察,可见表面的白霜已无,山萸肉表面红润光泽(糖易溶于水的性质),见图4。

2.2.3 生物显微镜下观察白霜 将山萸肉样品表面的白霜用刀片轻轻刮下来,置于载玻片上,勿加盖玻片,置生物显微镜下观察,可见大量无色透明晶体,偏光镜下具白色光泽,见图5。

图4 山萸肉表面的白霜（体视显微镜）Fig.4 White frost on the surfaces of C.officinalis （stereomicroscope）

图5 山萸肉表面白霜（生物显微镜）Fig.5 White frost on the surfaces of C.officinalis （biological microscope）

2.2.4 液质联用法验证糖的种类

2.2.4.1 分析条件 Shim-pack XR-ODS 色谱柱(2.0 mm ×100 mm,2.2 μm)；流动相乙腈-0.1%甲酸(75∶25)；体积流量0.3 mL/min；进样量10 μL。采用电喷雾离子源；负离子模式扫描；MRM模式采集。对色谱峰进行峰确认,筛选出样品溶液中含有果糖、葡萄糖和蔗糖,质谱参数见表2。

表2 质谱参数Tab.2 Parameters of mass spectrometry

2.2.4.2 对照品溶液制备 精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖对照品,加水制成质量浓度为1 ng/mL,即得。

2.2.4.3 供试品溶液制备 取表面有白霜的山萸肉1 g,置锥形瓶中,加10 mL 超纯水振摇5 下,立即过滤,取续滤液,即得。

2.2.4.4 测定条件 精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL,在“2.2.4.1” 项条件下测定,结果见图6。

2.2.4.5 测定结果 样品溶液中含有果糖、葡萄糖和蔗糖,葡萄糖和果糖的分子离子、子离子一样,色谱峰出峰时间一致,C18色谱柱无法将葡萄糖和果糖分离,故考虑采用HPLC-ELSD 和氨基柱将两者分离。

图6 各样品MRM 质谱图Fig.6 MRM mass spectra of various samples

2.2.5 HPLC-ELSD 验证糖的种类

2.2.5.1 色谱条件 Agilent ZORBAX NH2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈-水(75∶25)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；蒸发光散射检测器温度40 ℃。

2.2.5.2 对照品溶液制备 精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖对照品,加水制成质量浓度为0.2 mg/mL,即得。

2.2.5.3 供试品溶液制备 取表面有白霜的山萸肉1 g,置锥形瓶中,加10 mL 超纯水振摇5 下使白色物质溶解,立即滤过,取续滤液,即得。

2.2.5.4 测定条件 精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL,在“2.2.5.1” 项条件下测定,结果见图7。

2.2.5.5 测定结果 样品溶液中检出葡萄糖、果糖和蔗糖,其中葡萄糖和果糖含有量较高,蔗糖含有量较低。

图7 各成分HPLC-ELSD 图Fig.7 HPLC-ELSD chromatograms of various constituents

2.3 山萸肉表面霉菌的研究 对156 批山萸肉饮片性状进行研究发现,3 批样品表面有大量白毛,疑似发霉现象。将其置体视显微镜下观察,可见大量毛状物缠绕着山萸肉果实体,按“2.2.2” 项下方法处理,但仍有大量白毛,表明它不同于之前的白霜,难溶于水,附着果实体表面较结实,见图8。

将山萸肉表面的白毛用刀片轻轻刮下,置于载玻片上(不加盖玻片),置生物显微镜下观察,可见大量孢子或菌丝团块。将3 批表面疑似发霉的样品送至菌种鉴定单位进行细菌和真菌的筛查鉴定,结果为双孢旱霉,它是一种罕见的耐旱丝状真菌,极度耐干,有水分时生长更快。

图8 山萸肉表面发霉Fig.8 Mold on the surfaces of C.officinalis

3 讨论

本研究样品为国家评价性抽验品种山茱萸(山萸肉饮片156 批,酒萸肉饮片75 批),样品来自全国31 个省(区、市),地域覆盖率91.2%。其中山萸肉来源于药品经营企业61 批,占39.1%；生产企业46 批,占29.5%；使用单位49 批,占31.4%。对156 批山萸肉饮片进行性状研究,并建立了性状等级划分方法,按照饮片大小、色泽、光泽、杂质进行等级划分,共划分4 个等级。从1 级到4 级,山萸肉大小逐渐变小,颜色从紫红色到紫黑色或黑色,光泽从有到无,杂质从少到多。性状等级划分方法参考了中华中医药学会发布的《中药材商品规格等级标准汇编》[19],该标准也将山萸肉划分为4 个等级,划分4 个等级的主要区别点为每千克中鲜红色、暗红色、红褐色、紫黑色所占比例,以及杂质的多少。本研究建立的等级划分依据是颜色、大小、光泽度和杂质,4 个等级的表面颜色从紫红色到紫黑色或黑色(增加了黑色),颜色的变化经本课题稳定性试验佐证,即山萸肉的颜色随着存放时间的延长逐渐加深,也说明陈货的颜色较深。研究中发现山萸肉的大小差别明显,列入划分依据,色泽也是性状的一个主要鉴别点,一等品色泽光亮,而二、三和四等品色泽逐渐消失,色泽亦列入划分依据。

经对156 批山萸肉性状研究,发现23 批山萸肉表面具有一层白色物质,可区分为泛霜或发霉,根据试验结果分析,表面泛霜的原因是山萸肉为果实类中药材,含有糖类成分,经长期放置,表面析出糖类成分,表面光泽消失,且泛霜山萸肉颜色均较深,这与稳定性试验结果一致,即山萸肉的表面颜色随着饮片储存年限的增长,由紫红色变为黑色,逐渐加深,表面逐渐失去光泽。表面发霉的原因可能是储存不当,环境湿度过大,3 批鉴定为发霉山萸肉,经测定水分超过2020 年版《中国药典》 规定的限度,因此建议山茱萸应储存在通风干燥的环境中。