王彩虹，刘玉洁，曹 欢，朱丽娜，张乐乐，刘生杰,2*

（1.阜阳师范大学信息工程学院，安徽 阜阳 236041；2.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037）

洋葱（AlliumcepaL.）是一种在国内外广泛种植的农作物，被广泛应用于食品和医药行业[1]。洋葱不仅营养成分十分丰富，而且具有抗氧化、抗癌等药用价值，有学者研究表明，其中含有的多酚、甾体皂苷、多糖、精油等成分，具有降血压、降血糖、抗菌消炎、保护心血管等多方面的生理保健作用[2-5]，有“蔬菜皇后”之称[6]。

黄酮类化合物是指以黄酮为母体的一大类化合物，广泛分布于蔬菜、水果和药用植物中，具有抗癌、抗炎镇痛、降血糖、保肝、抗菌、抗氧化、抗肾结石等功效[7-12]。然而，黄酮类化合物不能在人体内合成，只能食品中获取，因此从天然物质里提取总黄酮的研究受到了人们的普遍关注。

根据前人大量研究可知，黄酮类化合物的提取方法主要有溶剂法、超声波辅助法、超临界流体萃取法、微波辅助萃取法、酶提取法等[13]，其中超声波辅助提取法作为一种植物有效成分提取分离的有效手段近年来被广泛应用，超声波具有空化能力和次级效应，能够使植物细胞壁被破坏，加速提取成分的释放和扩散，与溶剂充分混合，提高提取效率[14]。在洋葱总黄酮提取物活性研究中，基于响应面法综合探究洋葱总黄酮提取及抗氧化活性研究方面鲜有报道。因而，本研究采用超声辅助法提取洋葱中的总黄酮并优化其提取工艺，考查所得黄酮的体外抗氧化活性，为充分利用洋葱资源，提高农产品的附加值，进一步推广其食用、药用及经济价值提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫洋葱，购于当地大润发超市；芸香苷（BR，≥99%），上海展云化工有限公司；菲咯嗪-钠盐（BR，≥97%），上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、正丁醇、氯化钠、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、过硫酸钾、氯化亚铁、抗坏血酸、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯，西珑化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

XJA-100A型高速粉碎机：上海标本模型厂；DGT-P135电热鼓风干燥箱：合肥华德利科学器材有限公司；FA2004B电子天平（0.000 1 g）：上海越平科学仪器有限公司；SCQ-5201C超声波循环提取仪：上海声彦超声波仪器有限公司；Comfort1 Vivafow50超纯水机：德国Sartorius公司；TU-1950紫外分光光度计：北京普析公司。

1.3 实验方法

1.3.1 洋葱总黄酮的提取试验

将新鲜的洋葱切碎放入电热恒温鼓风干燥机中干燥至恒重，用粉碎机粉碎，过60目筛并收集粉末置于干燥器中备用。称取一定重量的洋葱粉加入一定浓度的乙醇，摇匀，放入超声波循环提取器中，设定特定的温度和时间。超声处理后，进行抽滤，收集上清液并测定提取液中总黄酮的含量并计算不同条件下提取到的洋葱总黄酮含量。

式中：C为洋葱提取液中总黄酮的浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为提取液的总体积，mL；m为洋葱粉末质量，g。

1.3.2 洋葱提取液中总黄酮含量的测定

以芸香苷为标准品，利用紫外分光光度法测定提取液中总黄酮的含量。具体测定方法参考文献进行操作[15]。最后以芸香苷质量浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，建立线性关系，得出回归方程和相关系数。

1.3.3 单因素试验

超声波辅助法提取洋葱总黄酮的过程中，超声提取温度（40、50、60、70、80℃）、超声波提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、液料体积质量比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g）、乙醇体积分数（45%、55%、65%、75%、85%）等因素对总黄酮的提取量均有影响，本研究采用单因素试验，研究各因素变化对洋葱总黄酮提取量的影响并对超声辅助法提取总黄酮的过程进行工艺优化。基本参数为超声提取温度为50℃、提取时间为1 h、液料体积质量比为20 mL/g、乙醇体积分数为75%，当一个参数变化时，其他参数保持不变，每组3个重复。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素实验所得的试验数据，并通过Box-Behnken中心组合设计原理进行4因素3水平的试验方案设计，以超声提取温度（X1）、超声提取时间（X2）、液料比（X3）、乙醇体积分数（X4）为自变量，洋葱总黄酮提取量（Y）为响应值，每一个自变量的低、中、高试验水平分别以－1、0、1进行编码如表1。根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，以获得最佳提取工艺参数，用最佳工艺条件提取洋葱总黄酮，收集提取液减压浓缩后进行真空冷冻干燥得到黄色粉末，加体积分数为75%乙醇配置成质量浓度5 mg/mL的洋葱总黄酮溶液，作为储备液备用。

表1 响应面分析试验因素与水平

1.3.5 体外抗氧化试验

通过样品溶液对ABTS自由基的清除率和对Fe2＋螯合效果的测定来反应洋葱总黄酮的体外抗氧化效果。洋葱总黄酮对ABTS自由基的清除率的测定参考Adebayo等[16]的方法，并用相应浓度的抗坏血酸溶液做相同的试验作为阳性对照，洋葱总黄酮对Fe2＋螯合效果的测定参考Li等[17]的方法，并用相应浓度的EDTA-2Na溶液做相同的试验作为阳性对照。分别按照公式（2）和（3）计算ABTS自由基清除率和Fe2＋螯合能力。

式中：Clear为ABTS自由基清除率；A0为用体积分数为75%的乙醇溶液与ABTS溶液在暗室下反应6 min于734 nm处测得的吸光值；A1为样品溶液与ABTS溶液在暗室下反应6 min于734 nm处测得的吸光值；A2为用体积分数为75%的乙醇溶液代替ABTS溶液在相同条件下测量的吸光度值。

式中：Ch为Fe2＋螯合能力；B0为用体积分数为75%的乙醇溶液与FeCl2溶液、菲咯嗪溶液、去离子水在室温下反应10 min于562 nm处测得的吸光值；B1为样品溶液与FeCl2溶液、菲咯嗪溶液、去离子水在室温下反应10 min于562 nm处测得的吸光值；B2为用体积分数为75%的乙醇溶液代替FeCl2溶液、菲咯嗪溶液和去离子水在相同条件下测量的吸光度值。

1.3.6 数据分析

每一个试验至少设计3个平行，结果均表示为平均值±标准偏差进行绘图分析。数据通过IBM SPSS Statistics软件进行统计学分析处理，进行单向方差分析（ANOVA），使用Origin Lab（Origin Pro 8.6软件）进行绘图。

2 结果与分析

2.1 洋葱总黄酮含量的测定

根据试验结果，吸光度与总黄酮含量之间的线性关系良好，回归方程为：y＝13.729 3x－0.009 6，相关线性关系是R2＝0.998 8。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 超声提取温度对洋葱总黄酮提取量的影响

由图1可知，超声波提取温度在40～50℃范围内，随着温度的增加，洋葱总黄酮提取量增加，在50～85℃范围内，随着温度的增加，洋葱总黄酮提取量降低，可能的原因是随着温度的升高，分子运动速度加快，使得物质的渗透扩散速度也加快，利于黄酮类化合物溶出[18]，但是当温度继续升高时，高温可能破坏黄酮类物质结构，总黄酮得率随着超声提取温度的变化趋势与田刚等对月季叶总黄酮的提取研究结果相似[19]。故超声波提取温度选择50℃左右为宜。

图1 超声提取温度对洋葱总黄酮提取量的影响

2.2.2 超声提取时间对洋葱总黄酮提取量的影响

图2 超声提取时间对洋葱总黄酮提取量的影响

由图2可知，超声提取时间在0.5～2.0 h，随时间的延长，提取量增加，但是提取时间超过2 h时，提取量下降。原因可能是随着超声时间增加，洋葱细胞的破碎程度逐渐增加，总黄酮的溶出率逐渐增大，超声时间的进一步延长，胞内其他物质可能溶出，进入提取液当中，进而影响提取效果[20]，且随超声时间的延长，超声波的空化效应可能引起部分黄酮类化合物结构发生变化，进而影响提取效果[21]，总黄酮得率随超声提取时间的变化趋势与马金魁等对辣木叶总黄酮的提取研究结果相似[21]。故超声提取时间选择2.0 h左右为宜。

2.2.3 液料体积质量比对洋葱总黄酮提取量影响

由图3可知，液料体积质量比在10～20范围内，随着液料比的增加，洋葱总黄酮提取量增加，但是液料体积质量比大于20时，洋葱总黄酮提取量呈现下降趋势。这是由于当溶剂含量较少时，对黄酮类化合物的充分溶出不利，使得洋葱总黄酮提取量偏低，当逐步提高溶剂用量时，总黄酮提取量增大可能是由于在超声波的辅助作用之下，总黄酮的溶解程度更大，当溶剂含量过多时，黄酮类化合物的溶出达到极限，其他化合物溶解增多，影响了黄酮的提取效果，导致其提取效果下降[22]。此外，溶剂过多会造成资源浪费并且不利于后续的浓缩，故液料体积质量比选择20∶1（mL/g）左右为宜。

图3 液料体积质量比对洋葱总黄酮提取量的影响

2.2.4 乙醇体积分数对洋葱总黄酮提取量的影响

由图4可知，乙醇体积分数在45%～75%范围内，随着乙醇体积分数的增加，洋葱总黄酮提取量增加，但是乙醇体积分数大于75%时，洋葱总黄酮提取量降低。这可能是由于乙醇体积分数较低时，水溶性物质大量溶解，影响黄酮类化合物的提取效果，使黄酮提取率量偏低[21]；随着乙醇体积分数的增加，黄酮类化合物与乙醇极性接近，溶出增多，使得洋葱总黄酮的提取率提高，但是当乙醇的体积分数进一步升高时，溶剂极性减小，部分黄酮苷类化合物溶解性减弱，同时部分脂溶性杂质溶出，导致洋葱总黄酮的提取率下降[23]。故乙醇体积分数选择75%左右为宜。

图4 乙醇体积分数对洋葱总黄酮提取量的影响

2.3 超声波辅助法提取洋葱总黄酮的工艺优化

2.3.1 响应面试验结果和模型方程的建立与显著性分析

基于单因素试验结果，采用响应面设计的原理，试验方案及结果见表2，试验方案中的29组实验中包括二十四个分析点和五个中心点。采用软件Design-Expert 8.06对所得数据进行回归分析，对各因素进行多元回归拟合后，可得回归方程：Y＝-9.532 2＋0.099 3X1-4.743 5X2＋1.675 2X3-0.030 9X4-0.053 5X1X2－0.001 5X1X3＋0.008 3 X1X4-0.017 0X2X3＋0.182 5X2X4-0.009 3X3X4-0.005 3X12-1.392 7X22－0.019 0X32－0.003 7X42。

根据表3方差分析可知，模型的p小于0.000 1，说明此回归模型极显著，该试验方法可靠。失拟项p值为0.485 1，大于0.05，不显著，说明非试验因素对试验结果的影响不大。此外，模型相关系数R2＝0.939 7，说明方程拟合程度良好，可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。表3中，一次项X1、X3、交互项X1X4、X2X4、X3X4和二次项X1²、X2²、X3²、X4²对提取量影响极显著，其他因素的影响均不显著，说明各个试验因素对洋葱总黄酮提取率的影响较为复杂，并非简单的线性关系。两因素之间交互作用的影响大小为：超声提取时间和乙醇体积分数＞超声提取温度和乙醇体积分数＞料液比和乙醇体积分数＞超声提取时间和超声提取温度＞超声提取温度和料液比＞超声提取时间和料液比。由分析表3中的F值可知，各个因素对洋葱总黄酮提取量的作用大小依次为：液料体积质量比（X3）＞超声提取温度（X1）＞超声提取时间（X2）＞乙醇体积分数（X4）。

表2 响应面试验设计及结果

23 24 25 26 27 28 29 0-1 01-110-1-1 11000 00-1000-1-1 0001-1-1 7.50 5.35 6.04 7.01 4.94 6.02 5.05

表3 方差分析

2.3.2 验证试验结果

经Design-Expert 8.06分析优化，得到洋葱总黄酮最优提取工艺条件为：超声温度60℃，超声时间2.5 h，液料体积质量比19.96∶1（mL/g），乙醇体积分数是85%。基于上述最优工艺条件，对其进行修正，即：超声温度60℃，超声时间2.5 h，液料体积质量比20∶1（mL/g），乙醇体积分数是85%。为验证模型的准确性，采用修正后优化的提取条件进行5次平行试验。结果表明采用上述优化条件进行试验，总黄酮得率为8.35 mg/g，获得的试验数值十分接近模型预测数值8.42 mg/g，说明由实验数据建立起的模型比较贴和实际，参数较为准确可靠。陈爱洋通过酶解法从洋葱中提取黄酮类物质，提取液中黄酮类化合物浓度为1.453 mg/g[24]，低于超声辅助法的提取率。

2.4 体外抗氧化试验结果与分析

根据1.3.5节的方法，按照公式（2）计算不同质量浓度的洋葱总黄酮与抗坏血酸对ABTS自由基的清除率，结果如图5。从图5中可以看出，随着总黄酮质量浓度的增加，ABTS自由基清除效果呈显著的浓度依赖性增加。当浓度达到0.6 mg/mL时，样品清除ABTS自由基的能力接近抗坏血酸，达到99.44%，说明洋葱总黄酮溶液具有较强的ABTS自由基清除效果。

根据方法1.3.5，按照公式（3）计算不同质量浓度的洋葱总黄酮与EDTA-2Na的Fe2＋螯和能力，结果如图6所示。从图6中可以看出，当样品浓度为0.2 mg/mL时，总黄酮Fe2＋螯和能力达到98.04%，抗氧化效果接近阳性对照品EDTA-2Na，说明洋葱总黄酮具有较强的Fe2＋螯和能力。

图5 洋葱总黄酮的ABTS自由基清除能力

图6 洋葱总黄酮的Fe2+螯和能力

有研究表明，不同溶剂提取出洋葱总黄酮溶液均有清除自由基活性的能力，与洋葱中含有的槲皮素、绣线菊苷等成分的含量有关，也可能与含较多还原性较强的羟基自由基有关[25]。不同洋葱的总黄酮提取物抗氧化活性有一定差异，祁英等对不同品种的洋葱总黄酮提取液的抗氧化活性进行比较，发现红洋葱的外皮提取液清除羟基自由基的能力最强，质量浓度为0.27 mg/mL时，其清除率为50%[26]，刘丽清对洋葱黄酮提取物的超氧阴离子自由基清除活性进行测定，发现当黄酮提取物浓度为0.33 mg/mL时，超氧阴离子自由基抑制率为71.65%[27]。ABTS自由基清除试验是一种方便有效的方法，反应是在抗氧化剂存在的情况下逐渐脱色的过程，易观察，本研究中从紫洋葱中提取出的黄酮类化合物具有较强的ABTS自由基清除能力和Fe2＋螯和能力。此结果高于凤眼莲叶提取到的黄酮化合物的抗氧化能力（60.91%）[22]。此外本试验研究结果与贾楠等对洋葱乙醇提取得到的洋葱总黄酮化合物对DPPH自由基和羟基自由基的清除效果较强[18]的结果相一致。

3 小结

以紫洋葱为原材料，选取超声提取温度、超声提取时间、液料体积质量比、乙醇体积分数四个因素探究了超声波辅助法对洋葱总黄酮提取量的影响，并进行响应面优化，得到超声波辅助法提取洋葱总黄酮的最佳提取工艺，在此基础上，评估了此方法提取出的洋葱总黄酮的抗氧化效果。结果表明：通过超声波辅助提取法从洋葱中提取总黄酮的最佳工艺条件为超声温度60℃，超声时间2.5 h，液料体积质量比20∶1（mL/g），乙醇体积分数是85%，在此条件下，洋葱中总黄酮的提取量达到8.35 mg/g。对在此工艺条件下提取的洋葱总黄酮的体外抗氧化效果表明，洋葱总黄酮具有较强的ABTS自由基的清除效果和Fe2+螯和能力，样品质量浓度达到0.6 mg/mL时，样品清除ABTS自由基的能力达到99.44%；当样品质量浓度为0.2 mg/mL时，总黄酮Fe2+螯和能力达到98.04%，抗氧化效果接近相同浓度下阳性对照品。此次试验结果提示，洋葱总黄酮具有较强的体外抗氧化能力，有可能为防治自由基相关性疾病的天然抗氧化药物、保健品或食品防腐剂的开发提供理论基础。