耿慧武，李清月，龚治忠，刘 刚

（安徽医科大学 生命科学学院，安徽 合肥 230032）

重金属胁迫会使细胞内的活性氧物质发生改变，对相关基因的结构、功能及表达产生影响，从而直接或间接导致细胞功能的改变，进而导致疾病的发生，甚至发生死亡[1-4]。酶是生命体内的遗传信息的最重要的表现形式，在正常生理状态下其表达维持在一个稳定的水平上，但当生物体受到胁迫时（如重金属），会引起细胞内的酶的结构和功能的变化，从而影响其生理生化功能，最终会影响生物的生存[1-3]。转录组学和蛋白质组学研究表明，细胞内酶的活力与其相关的mRNA丰度密切相关[1,4-7]。

GST和GSH-PX是细胞内最为关键的两种解毒酶，它们能消除细胞代谢过程中产生的有害过氧化物，保持细胞内的自由基相对平衡，避免膜系统的结构和功能遭到细胞内外有害物质的破坏[8]。谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）在生物体的多种细胞中均有表达，该酶主要参与细胞内的物质合成、代谢及运输，并发挥细胞解毒作用[8]。GST是一种重要的解毒酶，该酶利用谷胱甘肽（glutathione，GSH）的还原作用，清除细胞内产生的活性氧自由基，并起到修复细胞氧化损伤的作用[9]。此外，GST参与细胞的免疫反应，保护细胞免受外界胁迫造成的损伤，可以作为生物受环境污染的指示标记物，其表达水平在一定程度上可有效地反映生物体受环境毒物的损害程度[10-11]。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）对细胞内的GSH与过氧化物反应起到催化作用，使过氧化物变成无毒性物质，从而达到细胞解毒的作用。

铅及铅的化合物是工农业生产中重要的原料之一，也是生活中常见的重金属之一，但它们对生物体具有毒害作用，且不易被降解。任何形式排放到环境中的废铅被不断地积累，造成环境长时间、持续的污染。铅污染已经成为严峻的公共卫生问题，也是遗传毒理学研究的重要对象[12-13]。近年来，铅胁迫对细胞内遗传物质的转录及表达等遗传毒理机制的研究虽取得了进展，但还有许多机制尚需进一步解决。本研究用PbSO4模拟环境中的铅污染成分，以小鼠肝脏组织的Gsts和Gshpx基因及其酶活力作为实验研究对象，探究Pb2+胁迫下肝细胞内部分关键基因的mRNA表达变化及其编码的酶的活力变化规律，旨在通过酶学和转录组学数据来探讨Pb2+的毒性作用，揭示其对细胞的损伤作用机制，为重金属遗传毒理学研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与处理

本实验使用健康成年昆明种小鼠，购自安徽省实验动物中心，雌雄为1∶1，每只体重约（22.00±3.00）g，适应性饲养7 d后随机分4组，每组各5只。根据课题组前期实验结果确定Pb2+的质量分数为：低中高质量分数组的Pb2+质量分数分别为50、250、500 mg/kg，实验用的PbSO4由国药集团化学试剂有限公司提供。实验小鼠经口灌胃相应质量分数的PbSO4溶液和等体积的灭菌双蒸水（对照组），给药共30 d。各组小鼠饲养和管理条件相同，在实验过程中，密切观察并记录小鼠的情况，30 d后脱臼处死小鼠。

1.2 总RNA提取及逆转录反应

处死的小鼠迅速剖开腹腔取出肝脏，立即于液氮中研磨，然后用TRIzol试剂，按照说明书提取总RNA样品，经DYY-6C电泳仪（六一仪器厂，北京）电泳定性分析和DU-730核酸分析仪（BeckmanCoulter，USA）测定质量分数后，采用TaKaRa公司的M-MLV反转录酶反转录合成cDNA第1条链，-20℃保存备用。

1.3 mRNA表达水平及酶活力的测定

采用Primer 5.0软件设计Gsts和Gsh-px基因引物如表1，内参基因选用GAPDH，Real-time PCR采 用SYBRR Premix Ex TaqTM（Perfect real time）试剂盒，小鼠肝脏组织中Gsts和Gsh-px基因的mRNA转录水平按照说明书进行检测。Real-time PCR反应体系为20μL，反应程序为:95℃变性10 min，95℃变性5 s、65℃退火45 s、72℃延伸30 s，共45个循环。反应过程由Real-time PCR测定仪软件自动设定，每个样品重复3次。

表1 Gsts和Gsh-Px基因mRNA转录分析所用的引物序列

测定GST和GSH-PX酶活力时，先用匀浆器对小鼠肝脏组织研磨匀浆，取500μL匀浆液，混匀后按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书操作。

1.6 数据处理

所有实验数据采用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 22.0和Excel 2010软件对实验数据进行统计分析，以p＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 实验期间小鼠的症状

实验各组小鼠染毒前后体重变化不明显，无统计学差别；0和50 mg/kg组小鼠精神状态无变化；250 mg/kg组小鼠精神状态无变化，一周后出现食欲轻微下降；而500 mg/kg组小鼠明显出现食欲下降、精神沉郁和活动量减少等现象。对小鼠肝脏组织外观特征检视后发现，低质量分数组、对照组颜色变化不明显，观察肝脏组织没有出现明显中毒症状；中质量分数组小鼠，肝脏颜色稍微加深；而高质量分数组小鼠肝脏颜色发生较为明显的变化，呈现明显的暗红色且体积增大，表现较为明显的重金属中毒现象。

2.2 Gsts和Gsh-Px基因转录水平的变化

Pb2+处理后的小鼠肝脏组织的Gsts和Gsh-px基因mRNA的相对表达量发生了显著性变化。随着Pb2+质量分数的增加，Gsts和Gsh-px的mRNA相对转录水平逐渐降低，其中，高质量分数组的mRNA相对转录量最低，且与低、中质量分数组和对照组差异显著（p＜0.05），而低、中质量分数组的mRNA相对转录水平高于高质量分数组（p＜0.05），显著低于对照组（p＜0.05）如图1。

2.3 Pb2+对小鼠肝脏GST和GSH-PX酶活力的影响

Pb2+染毒后，小鼠肝脏组织的GST和GSHPX酶活力均呈下降趋势表2，图2～3；与对照组相比较，各实验组的GST酶活力呈极显著的差异性（p＜0.01），分别下降了11.90%、32.62%和50.11%，其中下降率最高的为高质量分数实验组（50.11%），最低的为低质量分数实验组（11.90%）。与对照组相比，各染毒组的GSH-PX酶的活力也呈明显的下降趋势，且差异极显著（p＜0.01），其活力分别下降了6.44%、49.88和71.22%，其中下降率最高的为高质量分数实验组（71.22%），最低的为低质量分数实验组（6.44%）。

图1 Pb2+胁迫下Gsts和Gsh-Px基因的mRNA转录水平变化

图2 不同质量分数Pb2+胁迫下小鼠肝脏组织中GST酶活力

图3 Pb2+胁迫下小鼠肝脏中GSH-PX酶活力

表2 不同Pb2+质量分数下GST和GSH-PX酶活力值(mean±SD)

2.4 Pb2+质量分数对mRNA表达量及其酶活力的相关性分析

生物统计学分析发现：Gsts和Gsh-px基因的mRNA转录水平随Pb2+质量分数增加均呈显著下降趋势，各组的2种基因的mRNA转录水平与Pb2+质量分数呈显著负相关性，如图4；各组的GST和GSH-PX酶活力与Pb2+质量分数呈明显负相关性如图5；GST酶活性随Gsts基因的mRNA表达水平的下降而下降，两者表现出明显的正相关性如图6；同样，GSH-PX酶活性随着Gsh-px基因的mRNA表达水平的下降而下降，两者表现出明显的正相关性如图7。

图4 Pb2+质量分数与Gsts和Gsh-px基因转录水平相关性分析

图5 Pb2+质量分数与小鼠肝脏GSTs和GSH-PX酶活力相关性分析

图6 Gsts表达量与GSTs酶活力相关性分析

图7 Gsh-px表达量与GSH-PX酶活力相关性分析

3 讨论与结论

工业和农业生产过程中产生的重金属污染物一旦被一些企业非法直接排放到环境中即对周围土壤和水体产生污染，这些重金属以各种形式在环境中积累，引起人们的广泛关注[13]。铅及其化合物是一种稳定性较高且不可降解的污染物，会对生物体内的器官、组织及细胞产生明显的毒害作用[12-13]。环境中的铅进入细胞后，能够强烈影响相关基因的mRNA的转录水平；同时，铅离子可以与机体内的蛋白质分子或者酶的位点相互结合，从而影响体内酶的生物活性，导致细胞的凋亡或引起组织、器官的病变，严重影响机体的功能[14-15]。本实验研究表明，低质量分数的、长时间铅胁迫不会导致小鼠死亡，但会对小鼠的肝脏组织具有一定的毒性效应，形成不可逆转的功能性损伤；肝脏是动物体内重要的解毒器官，也是大多数重金属作用的重要靶器官。此外，肝脏细胞比其他组织器官的细胞对Pb2+更敏感。中质量分数组（250 mg/kg）和高质量分数组（500 mg/kg）的Pb2+使小鼠肝脏颜色发生变化，mRNA的转录水平和酶活力均显著降低，与本课题组前期研究结果类似[12]。

在Pb2+暴露后，小鼠肝脏内的Gsts和Gsh-px基因的转录水平受到较为显著性的抑制，转录水平出现明显的下降，与之前报道的Pb2+暴露家蚕细胞内的Gsts和Gsh-px基因转录趋势有所区别[8]。遗传毒理学的研究表明，肝脏组织在重金属的胁迫下可引起细胞的氧化胁迫。GST和GSHPX是重要的解毒酶[16-17]。GSH-PX在细胞内能通过消除代谢产生的有害物质，尤其是消除过氧化物来保持细胞内自由基的平衡，保护生物膜系统的结构和功能的正常作用。研究表明，Pb2+能够使家蚕体内的GST与GSH-PX酶的活力升高，但却加剧了细胞内生物膜结构和功能的损伤[18]。本研究表明，小鼠肝脏组织的GST和GSH-PX的酶活力与Pb2+质量分数呈显著的负相关性，并且随着Pb2+质量分数的升高，酶活力逐渐下降；当质量分数升高至500 mg/kg时，两种酶的活力均降到最低，与对照组出现极显著差异性。研究结果同时表明，小鼠肝脏组织内的GST和GSH-PX酶活力与Gsts和Gsh-px基因的mRNA的转录水平呈明显的正相关性，表明随着Pb2+质量分数的升高，Gsts和Gsh-px的mRNA的转录水平降低，进而影响GST和GSH-PX酶活力[8]。

实验表明，Pb2+胁迫能显著降低小鼠肝脏组织中的Gsts和Gsh-px基因转录水平，同时能够抑制GST和GSH-PX酶的活力，且均呈显著的下降趋势。Gsts和Gsh-px基因的mRNA的转录水平及其酶活力与Pb2+的质量分数均呈负相关性；酶活力变化趋势与其基因的mRNA转录水平呈明显的正相关性，这为今后进一步探讨重金属对肝细胞基因的转录调控及生物酶活性影响的机制提供了一定的理论依据[8,19-20]。

4 小结

铅离子一方面通过抑制小鼠肝脏细胞内谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶编码基因的转录，降低了相应mRNA的水平，减少了酶的表达量，另一方面通过降低这两种酶的活力，使其不能正常发挥生物学功能，导致染毒后的小鼠呈现出剂量依赖型精神状态和活动状态改变及肝脏表观变化。