冯跃，张永涛，夏利锋，马永刚

（中国人民武装警察部队海警总队医院 外二科，浙江 嘉兴 314000）

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来我国结直肠癌发病率和病死率均呈明显的上升趋势，2015年我国结直肠癌估算新发和死亡病例数分别为37.6 万和19.1 万[1]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路作为细胞生长、增殖和抗凋亡的重要调节通路，与癌症的发生、发展密切相关[2-3]。有研究显示，结直肠癌的恶化、转移与PI3K/Akt/mTOR 信号通路有关[4-5]。因此，本研究通过检测PI3K/Akt/mTOR 信号通路中人类第10 号染色体缺失的编码与PTEN、p-Akt、p-mTOR 在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达，探究其相关蛋白对结直肠癌的影响及与临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2017年12月中国人民武装警察部队海警总队医院52例外科手术切除或内镜完整切除的结直肠癌活检标本，并取相同患者的癌旁正常组织（距肿瘤切缘≥4 cm）作为对照，标本离体后用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。患者男性30例，女性22例；年龄25 ～76 岁，平均（53.8±13.2）岁；无淋巴结转移38例，有淋巴结转移14例；浸润未达浆膜层32例，浸润达到浆膜层20例；低分化结直肠癌18例，中、高分化结直肠癌34例；根据美国癌症联合协会和国际抗癌联盟的结直肠癌分期标准[6]，临床分期Ⅰ、Ⅱ期患者24例，Ⅲ、Ⅳ期患者28例。

1.2 主要试剂

鼠抗人PTEN、兔抗人p-Akt、兔抗人p-mTOR 单克隆抗体均购自德国默克公司，免疫组织化学SP 试剂盒、DAB 显色剂购自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 免疫组织化学SP 法及结果判断

采用免疫组织化学SP 法检测PTEN、p-Akt、p-mTOR 在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达。实验操作均严格按照说明书进行。细胞核出现棕黄色颗粒为p-mTOR 阳性，细胞核和细胞质中出现棕黄色颗粒为PTEN、p-Akt 阳性。随机选取10 个高倍镜视野，根据染色程度分为：无染色（-）、浅黄色（+）、棕黄色（++）、黄褐色（+++），分别代表0～3 分。根据视野内阳性细胞所占比例分为：≤10%（-）、＞10%～25%（+）、＞25%～50%（++）、＞50%（+++），分别代表0～3 分。最终评分=染色强度评分×阳性细胞所占比例评分，最终评分≥3 分为阳性，≤2 分为阴性。

1.4 随访

随访时间截至2020年1月31日。通过电话、信函和查阅医院病案记录等方式随访。所有患者随访资料完整。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，多因素分析采用Logistic 回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌与癌旁正常组织中PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性率比较

结直肠癌与癌旁正常组织中PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），PTEN 阳性率低于癌旁正常组织，而p-Akt、p-mTOR 阳性率高于癌旁正常组织。见表1和图1。

2.2 结直肠癌患者PTEN、p-Akt、p-mTOR 表达与临床病理特征的关系

有淋巴结转移与无淋巴结转移患者的p-Akt 和p-mTOR 阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移患者较高。肿瘤浸润达到浆膜层与未达浆膜层患者的p-Akt 阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤浸润达到浆膜层患者较高。肿瘤低分化与高、中分化患者的p-Akt 阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），低分化患者较高。临床分期Ⅲ期、Ⅳ期与Ⅰ期、Ⅱ期患者的p-Akt和p-mTOR 阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅲ期、Ⅳ期患者较高。其余临床病理特征患者的PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 结直肠癌与癌旁正常组织中PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性率比较 [n =52，例（%）]

图1 PTEN、p-Akt、p-mTOR 在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达 （SP×100）

表2 不同临床病理特征结直肠癌患者的PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性率比较例（%）

续表2

2.3 p-Akt 表达与结直肠癌临床病理特征的多因素分析

以表2中差异有统计学意义的因素为自变量，p-Akt 是否阳性为因变量，进行一般多因素Logistic 回归分析（引入水准为0.05，剔除水准为0.10），结果显示：结直肠癌患者临床分期Ⅲ、Ⅳ期[=4.098（95% CI：2.337，7.134）]是p-Akt 阳性表达的影响因素（P＜0.05），见表3。

2.4 PTEN、p-Akt、p-mTOR 表达与结直肠癌患者预后的关系

52例随访患者中，死亡30例。PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性与阴性患者的4年生存率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），PTEN 阳性患者高于阴性患者，p-Akt、p-mTOR 阳性患者分别低于p-Akt、p-mTOR 阴性患者。见表4和图2～4。

表3 结直肠癌患者病理特征的多因素Logistic 回归分析参数

表4 PTEN、p-Akt、p-mTOR 阳性与阴性患者的4年生存率比较 %

图2 PTEN 阳性和阴性结直肠癌患者的生存曲线

图3 p-AkT 阳性和阴性结直肠癌患者的生存曲线

图4 p-mTOR 阳性和阴性结直肠癌患者的生存曲线

3 讨论

结直肠癌可以通过淋巴、血液循环及直接浸润等途径，播散到其他组织和脏器，因此治疗的关键在于早期发现、及时诊断和手术根治[7-8]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路作为肿瘤领域的研究热点，在多种肿瘤中异常激活[9-11]。PI3K/Akt/mTOR 与结直肠癌细胞的增殖、侵袭、凋亡及细胞周期密切相关[12]。在结直肠癌进展过程中，c-FOS和PTEN可能是该通路的关键基因改变[13]。mTOR作为下游基因，活化后可以抑制癌细胞自噬。凋亡也是结直肠癌发生、发展的重要机制，PI3K/Akt 通路可以通过Caspase、Bcl、FOXO和mTOR基因抑制结直肠癌细胞的凋亡[14-15]。值得一提的是，PI3K/Akt/mTOR 通路还能通过调控血管形成而影响化疗药物的耐药性[16-17]。因此，探究PI3K/Akt/mTOR 信号转导蛋白在结直肠癌中的表达具有潜在价值。

PTEN抑癌基因具有双重特异性磷酸酶活性，能将三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化转化为磷脂酰肌醇二磷酸，是PI3K/Akt/mTOR 信号通路的负调节通路[18-19]。PTEN 在结直肠癌组织中的阳性率低于癌旁正常组织，说明PTEN 的低表达或不表达，导致结直肠细胞生长状态失控，进而使肿瘤发展成癌症的可能性增加。从临床病理特征上看，PTEN 在结直肠癌组织中的表达与患者年龄、性别、有无淋巴结转移、浸润程度、肿瘤分化程度、临床分期均无关。预后分析中，PTEN阳性患者4年生存率高于阴性患者，说明PTEN 与结直肠癌患者预后相关。

Akt 在多种细胞生长过程中发挥关键作用，如葡萄糖代谢、凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移，Thr308 和Ser743 位点可以被磷酸化，从而激活其底物mTOR[20]。在本研究中，p-Akt 在结直肠癌组织中的阳性率高于癌旁正常组织，说明Akt 的活化与结直肠癌发展相关。从临床病理特征上来看，Akt 的表达与有无淋巴结转移、浸润程度、肿瘤分化程度、临床分期有关，且与贺雅静[21]的研究中p-Akt 在其他消化道癌症中的作用吻合，进一步验证了p-Akt 在肿瘤发生、发展中的作用。Logistic 回归分析显示p-Akt 与结直肠癌患者的临床分期有独立影响关系，p-Akt 可以作为临床上判断结直肠癌恶性程度的重要指标之一，也是治疗结直肠癌的潜在靶点。同时，p-Akt 阳性患者4年生存率低于阴性患者，说明p-Akt 表达可能会加重结直肠癌患者预后不良。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR 活化后介导PI3K/Akt/mTOR 信号通路下游分子，影响细胞的生长、凋亡及代谢[22-23]。本研究中p-mTOR 在结直肠癌组织的阳性表达率高于癌旁正常组织，说明mTOR 磷酸化与结直肠细胞癌变有关。同时，p-mTOR 在结直肠组织中的阳性表达与有无淋巴结转移、临床分期有关，说明mTOR 功能失调与结直肠癌的发生、发展密切相关；p-mTOR 阳性患者4年生存率低于阴性患者，说明p-mTOR 表达可能导致结直肠癌患者预后恶化。

抑制PI3K/Akt/mTOR 通路对结直肠癌的治疗有重要意义[24-25]。目前已进入临床研究的药物，如PI3K 抑制药LY294002，PI3K 和mTOR 双重抑制药NVP-BEZ235，mTOR 抑制剂依维莫司和替西罗莫司等均显示出一定疗效。并且针对不同PI3K 亚型的特异性化合物也正在被开发，如p110β 特异性抑制药IC87114，p110γ 特异性抑制药AS-24252[16]。总之针对PI3K/Akt/mTOR 通路开发潜在靶向药势必会使结直肠癌患者受益。

综上所述，PI3K/Akt/mTOR 信号通路与结直肠癌密切相关，PTEN、p-Akt、p-mTOR 的表达都会影响到结直肠癌的发展，同时p-Akt、p-mTOR 与结直肠癌患者的一些临床病理特征有关，可以作为临床参考指标，并且PTEN、p-Akt、p-mTOR 与结直肠癌患者预后生存率有关，可以用于推测患者的预后。尽管PI3K/Akt/mTOR 信号通路中仍有许多相关蛋白和基因没有进行探究，影响机制尚不明确，但是本研究中的PI3K/Akt/mTOR 信号通路为临床提供了新的参考指标，PI3K/Akt/mTOR 信号通路中的p-Akt、p-mTOR蛋白有潜力作为结直肠癌的新治疗靶点。