王博寒,史锁芳

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

支气管哮喘(简称哮喘)，是一种以可逆性的气道高反应为特点、由多种细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。全球约有3亿哮喘患者，其发病率呈逐年上升的趋势[1]。哮喘的发病机制尚未明确，除了气道高反应、免疫-炎症反应等，氧化应激在哮喘的发病机制中占据重要地位，如“氧化/抗氧化失衡”、气道“自由基损伤”等学说[2]。氧化应激可以刺激MUC5AC过表达，使黏液分泌增多，限制黏膜纤毛摆动，降低气道清除能力，进而形成黏液栓引起气道阻塞，是哮喘死亡的重要因素之一[3]。故抑制氧化应激减少MUC5AC表达在哮喘的治疗过程中尤为重要。白藜芦醇具有多种生物活性，是公认的具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用和癌症化学预防剂[4]。深入挖掘氧化应激在哮喘中的作用机理，探究白藜芦醇抗氧化应激在哮喘治疗中的作用靶点具有重要的意义。基于以上认识，本实验以人气道上皮细胞16HBE为研究对象，并通过H2O2诱导细胞氧化应激模型，加以白藜芦醇干预，检测氧化应激相关指标以及MUC5AC表达水平，探讨白藜芦醇对H2O2作用下人气道上皮细胞中MUC5AC表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人气道上皮细胞16HBE(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；白藜芦醇(S1396)(美国Selleck 生物科技有限公司)；胎牛血清(41F9144K)、RPMI 1640培养基(8117079)、青霉素-链霉素(C0222)(美国Thermo fisher scientific公司)；H2O2(101830329)(美国Sigma公司)；活性氧ROS测试盒(E004-1-1)、总抗氧化能力T-AOC测试盒(A015-1-2)(南京建成生物工程研究所)；MUC5AC抗体(sc-21701)(美国Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG(7074S)(美国Cell Signaling科技公司)；蛋白裂解液(106M4000V)、蛋白酶抑制剂(410035)、磷酸酶抑制剂(510024)(瑞士Biotool公司)；BCA蛋白定量试剂盒(P0010)(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL发光显色液(170-5060)(美国Bio-Rad公司)。

1.2 主要仪器

HeraCell 150i型培养箱(美国Thermo fisher scientific公司)；Ni-U型正置荧光显微镜(德国Jena公司)；125-BR垂直电泳仪、221-BR电转移装置、ChemiDocTM型成像系统(美国Bio-Rad公司)；VIIA7DX型实时荧光定量PCR仪(新加坡 Life technologies公司)。

1.3 细胞培养及分组

配制含有10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基培养16HBE细胞，细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中。待细胞融合达70%～80%时用0.5%胰蛋白酶消化进行后续实验。

分组1:①对照组；②H2O2不同浓度组(H2O2浓度分别为5、10、20 μmol/L)，均处理48 h。

分组2：将细胞分为H2O2不同时间组(5 h、24 h、48 h、72 h)。分别予以H2O220 μmol/L干预细胞相应时间。

分组3：①对照组；②H2O2组(H2O220 μmol/L)；③H2O2+白藜芦醇组(H2O220 μmol/L+白藜芦醇50 μmol/L)；④白藜芦醇组(白藜芦醇50 μmol/L)，均处理24 h。

1.4 检测指标

1.4.1 活性氧ROS水平

按“分组1”和“分组3”相应要求处理后的16HBE细胞，采用无血清RPMI 1640培养基稀释 DCFH-DA荧光探针，稀释比例为1∶1 000，每孔加入500 μL，放置培养箱避光孵育30 min。弃去孔内液体，PBS冲洗2次，每孔加入PBS 500 μL荧光显微镜下观察并拍照。

1.4.2 总抗氧能力T-AOC水平

按“分组3”相应要求处理后的16HBE细胞进行T-AOC检测。1)配制测定管及对照管溶液，充分混匀后置于37 ℃水浴锅水浴30 min。2)对照管和测定管中分别加入4号试剂和5号试剂，测定管加样品。3)漩涡震荡充分混匀后，采用酶标仪设置吸光度为520 nm测定吸光度。

细胞中T-AOC能力=(测定管OD值-对照管OD值)/0.3×40/待测蛋白浓度

1.4.3 MUC5AC蛋白表达水平

采用Western blot法检测MUC5AC蛋白表达水平。按“分组1”和“分组3”要求处理后弃去原有培养液，16HBE细胞PBS清洗后加入适量体积细胞裂解液。收集细胞裂解液上清采用BCA法测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后切取目的条带。5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，加入MUC5AC和β-actin抗体4 ℃过夜。TBST洗涤后加入羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h，TBST洗涤后采用ECL发光液显色。实验结果采用Image J软件进行灰度值分析。

1.4.4 MUC5AC mRNA水平

采用RT-PCR法检测MUC5AC mRNA水平。按“分组1”“分组2”和“分组3”要求处理后弃去原有培养液，16HBE细胞采用PBS清除培养基后加入RNAiso Plus分离总RNA。采用 First-Strand Synthesis 试剂盒进行逆转录。取逆转物产物进行PCR扩增，扩增条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 共 45个循环，以 β-actin基因为内参，引物设计如下：

β-actin:上游5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′，下游5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′，MUC5AC：上游5′GCTTCCTGCTCCGAGATGT3′,下游 5′AAGACGCAGCCCTCATAGAA3′。

通过计算 2-ΔΔCt分析MUC5AC mRNA相对表达量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 H2O2诱导16HBE细胞氧化应激

DCFH-DA探针检测“分组1”的 16HBE细胞ROS水平，结果显示H2O2作用后可以增高16HBE细胞内ROS水平，且随着H2O2浓度升高，ROS水平也随之升高。见图1。

图1 H2O2诱导16HBE细胞氧化应激

2.2 H2O2诱导16HBE细胞MUC5AC表达量

RT-PCR法检测“分组1”和“分组2”MUC5AC mRNA水平，结果显示H2O2作用后16HBE细胞的MUC5AC mRNA水平随浓度升高而升高，与对照组比较，20 μmol/L H2O2作用后MUC5AC mRNA水平升高了约6倍(P<0.001)，见图2A。H2O2不同时间组(5 h、24 h、48 h、72 h)MUC5AC mRNA水平比较，作用24 h的MUC5AC mRNA水平最高，比对照组升高了约5倍(P<0.001)，见图2B。Western blot法检测“分组1”的MUC5AC蛋白水平，与对照组比较，20 μmol/L H2O2作用后MUC5AC蛋白水平升高了约2倍(P<0.001)，见图2D。综上，H2O2能够诱导16HBE细胞MUC5AC表达量增加，H2O220 μmol/L干预24 h MUC5AC表达量最高。

注:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 白藜芦醇抑制H2O2诱导的16HBE细胞氧化应激

检测“分组3”的 16HBE细胞ROS和T-AOC水平，20 μmol/L H2O2作用后可以升高细胞内ROS水平，而加入白藜芦醇50 μmol/L共同作用后可以抑制H2O2诱导的细胞内ROS升高，见图3A。对于T-AOC水平，20 μmol/L H2O2作用后T-AOC水平较对照组降低了约2/7(P<0.05)，与H2O2组比较，H2O2+白藜芦醇组的T-AOC水平升高了约0.3倍(P<0.05)，见图3B。

注:*P<0.05。

2.4 白藜芦醇逆转H2O2诱导的MUC5AC表达

检测“分组3”的16HBE细胞的MUC5AC mRNA水平和MUC5AC蛋白水平，与对照组比较，H2O2组的MUC5AC mRNA水平升高了约5倍(P<0.001)，MUC5AC蛋白水平升高了约0.8倍(P<0.001)。与H2O2组比较，H2O2+白藜芦醇组的MUC5A CmRNA水平降低了约5/6(P<0.001)，MUC5AC蛋白水平降低了约2/5。说明白藜芦醇能够逆转H2O2诱导的MUC5AC表达(P<0.001)。见图4。

注:***P<0.001。

3 讨论

在人体内环境稳定的情况下，氧化和抗氧化处于动态平衡的状态。氧化应激是指在多种理化刺激及自身免疫等因素的影响下，体内产生过多的ROS，氧化程度超出了氧化物的清除，氧化和抗氧化处于失衡状态，导致中性粒细胞浸润和氧化损伤。大量临床和动物实验研究发现，氧化应激是哮喘发生和发展的重要机制之一[5]。氧化应激启动并加重炎症反应，其主要物质活性氧ROS是一种强化学介质，能作用于细胞膜的受体激酶，调控多种信号转导途径，激活对氧化还原敏感的转录因子，使其与MUC5AC基因对应的位点结合，促进 MUC5AC基因转录与翻译，导致气道黏液过度分泌[6]。因此针对黏液分泌的信号通路进行抗氧化应激处理，能够有效抑制黏液高分泌。基于白藜芦醇的抗氧化、抗炎等作用，本实验提出了白藜芦醇能够抑制氧化应激减少黏蛋白MUC5AC表达的假说。

ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇，在调控细胞生物学行为中起到重要作用。过量的ROS能够损伤细胞的大分子结构例如DNAs，类脂和蛋白质，造成组织损伤，参与黏液高分泌[7]。T-AOC代表的是机体总抗氧化体系，包括了抗氧化酶(如SOD等)、非抗氧化酶(H2S等)两类抗氧化系统，这些抗氧化物质能够清除自由基，减轻氧化应激对机体的损伤[7]。本研究发现，H2O2刺激16HBE细胞后，细胞内ROS水平升高，T-AOC水平降低，证实H2O2诱导的氧化应激模型成立。白藜芦醇作用后，与模型组相比，ROS水平降低，T-AOC水平升高，证实白藜芦醇具有抑制氧化应激的作用。

气道黏液高分泌是支气管哮喘的重要病理学改变之一[8]，黏液分泌增多会导致纤毛清除功能受损，进而形成黏液栓，引起气道阻塞、气流受限，并为细菌感染提供机会。黏蛋白是气道黏液的主要成分，由气道上皮杯状细胞及黏膜下腺体产生，可分为膜结合型和分泌型。MUC5AC为分泌型黏蛋白，是哮喘发作时气道黏液中的主要黏蛋白，对维持正常的黏液弹性和纤毛清除功能起着重要作用。故MUC5AC的过量表达可以作为气道黏液高分泌形成的主要标志[9]。本研究发现，用H2O2刺激16HBE细胞后，MUC5AC mRNA及其蛋白表达明显增高，揭示H2O2能够诱导16HBE细胞MUC5AC表达量增加。而白藜芦醇作用后，与模型组相比，MUC5AC mRNA及其蛋白表达明显降低，证实白藜芦醇能够逆转H2O2诱导的MUC5AC过表达。

黏蛋白合成的机制研究众多，且较为复杂，已知MAPK/p38、JAK/STAT、Ras/Raf/Erk/MAPK等信号通路均在其合成过程中发挥着重要的作用[10]。对于氧化应激诱导黏液高分泌的具体机制尚不明确，本研究通过体外实验进一步验证了氧化应激与MUC5AC过表达相关，且白藜芦醇能够抑制氧化应激减少MUC5AC表达，然而其具体作用机制仍待进一步研究。