胡灵燕，张旗，蔡淑美，张烁，冯燕婷，陈玲凡，辛志明*

(1.福建医科大学福建省新药安全性评价中心，福建 福州 350122；2.福建医科大学药学院天然药物学系，福建 福州 350122；3.福建医科大学临床医学部，福建 福州 350122)

焦虑症的发生率逐年上升，已经成为严重影响人们生活质量的主要精神疾病之一(约占11.4%)[1-2]，给社会和个人都带来沉重的负担。药物治疗是目前干预焦虑症的主要手段之一，其中最为常用的药物是苯二氮卓类(BZDs)和选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)[3]，但由于其副作用和起效慢等不足在临床应用中受到限制[4-6]，因此亟待研发安全有效的抗焦虑药物。从传统中药寻找抗焦虑的活性成分并深入进行相关的关键科学问题探索研究是创制新型抗焦虑药物的重要途径。

开心散始载于唐代孙思邈《备急千金要方》卷十四“小肠腑·风虚惊悸第六”，方剂组成为“石菖蒲远志各二两，茯苓人参各三两”，主治“主心气不定，五脏不足，甚者忧愁悲伤不乐，忽忽喜忘，朝瘥暮剧，狂眩方”，是治疗中医情志病的经典方[7]。后世医家主要用开心散治疗心气不足、神志不宁、健忘失眠、心怯怔忡等证，即西医范畴的抑郁、焦虑症状、学习记忆障碍等[8]，可见开心散主要用于精神性疾病的治疗。近年来，开心散对精神性疾病治疗的研究主要集中于抗抑郁和改善老年痴呆症的研究，而开心散对焦虑障碍的治疗作用尚未阐明。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 药品与试剂

开心散中成分人参、茯苓、远志、石菖蒲(北京同仁堂药店)；地西泮(规格：2 mL/10 mg，天津金耀药业有限公司)；5-HT试剂盒(批号：C0101070172，武汉华美生物工程有限公司)；色谱乙腈(赛默飞世尔科技中国有限公司)。

1.3 仪器设备

酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(Waters 公司)；色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)，ZORBAX SB-Aq(5 μm，4.6 mm×250 mm)；高效液相色谱串联二维线性离子阱-静电场轨道阱质谱仪LTQ-Orbitrap XL型(美国赛默飞世尔科技公司)。

2 方法

2.1 开心散提取物的制备

开心散(KXS)：人参18 g，茯苓18 g，远志12 g，石菖蒲12 g。10 倍量60% 乙醇回流提取3次，每次1 h，过滤，滤液合并，减压浓缩即得复方的提取物，浓度为0.9 g/mL。

2.2 开心散提取物抗焦虑作用

将大鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型组,阳性药组(地西泮1 mg/kg),开心散(KXS)的高剂量(12 g/kg)、中剂量(6 g/kg)、低剂量(3 g/kg)组。将每只大鼠放在电击仪(30 cm× 24 cm×21 cm)中适应5 min。随后，以30 s的间隔持续刺激2 s，连续10次进行选择性足底震击(0.5 mA)[9]，连续刺激7 d后，各组大鼠给药7 d后进行高架十字迷宫测试和旷场试验，本实验选用高架十字迷宫实验中的开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比以及旷场实验中的中央区滞留距离作为评价药物抗焦虑作用的指标；并用酶联免疫吸附法对大鼠脑组织5-HT的含量进行测定，以探讨其抗焦虑作用情况。

2.2.1 高架十字迷宫实验

灌胃给药第7 d，给药1 h后进行高架十字迷宫实验。实验前先将大鼠置于开场中活动5 min，然后将大鼠置于迷宫中央，使其头部正对其中一个开放臂，用计算机跟踪记录大鼠在高架十字迷宫上的活动情况，记录时间为5 min。以大鼠的开臂次数百分比(OE%)即开臂次数/(开臂次数+闭臂次数)和开臂滞留时间百分比(OT%)即开臂滞留时间/(开臂时间+闭臂时间)作为评价药物抗焦虑作用的指标[10]。

2.2.2 旷场实验

旷场实验采用四联立方体木敞箱(100 cm×100 cm×50 cm)，周壁与底面为黑色，底面分为中央区与外周区且两区域面积相同。旷场实验开始前5 min将大鼠移至测试区以适应陌生的实验环境。实验时，将大鼠置于矿场实验中央，然后开始计时，每组5 min。通过安置的摄像监测系统以及计算机安装的动物行为学软件记录其在5 min内滞留于中央区的距离百分比[11]。

2.2.3 脑组织取材

行为学测试结束后，各组大鼠(2%戊巴比妥钠，40 mg/kg)麻醉后，腹主动脉取血，立即断头，迅速取出大脑，用冰生理盐水冲洗除去血液，滤纸拭干，快速在冰盘上分离出海马组织，放入匀浆器中加生理盐水冰浴中磨成匀浆液，4 ℃高速离心20 min(离心速率为18 000 r/min)，取上清液放-80 ℃超低温冰箱中保存待测。

2.2.4 海马组织中5-HT水平的测定

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠5-羟色胺(5-HT)水平。往预先包被5-HT和NE 抗体的ELISA检测试剂盒的包被微孔中，依次加入标准品、标本、HRP标记的检测抗体，经过温育洗涤。用底物 TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸性终止液的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的5-HT含量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定样品的吸光度(OD值)，计算样品浓度，具体操作参照ELISA说明书步骤。数据用 SPSS18.0 统计软件进行分析处理，组间比较采用单因素方差分析。

2.3 开心散提取物的色谱条件

精密称量开心散提取物0.129 4 g，用甲醇超声溶解，定容于10 mL容量瓶，得到浓度为12.94 mg/mL开心散的供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，待用。色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱程序：0～5 min，3% A；5～7 min，3～8% A；7～10 min，8% A；10～17 min，8～15% A；17～20 min，15～18% A；20～25 min，18～25% A；25～28 min，25～30% A；28～32 min，30% A；32～36 min，30～32% A；36～37 min，32～40% A；37～42 min，40～48% A；42～50 min，48～80% A；50～52 min，80～85% A；52～58 min，85 A。流速：0.3 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；检测波长：254 nm。

2.4 开心散提取物的质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，LTQ-Orbitrap质谱仪。电离参数设置如下：负离子模式；方法设置如下：鞘气(氮气)流量为30 arb，辅助气体(氮气)流量为5 arb，喷雾电压4.0 kV，毛细管温度为350 ℃，毛细管电压为25 V。扫描方式为全扫描，质量扫描了m/z 200～2 000的质量范围。将碰撞诱导解离(CID)的碰撞能量调整为最大强度峰的30%，前体离子的分离宽度为m/z 2.0 Da。启用了动态排除以防止重复，并且将重复计数设置为5，动态重复时间为30 s，动态排除时间为60 s。

2.5 统计学处理

统计学处理采用SPSS17.0软件，以均数±标准差表示所有数据，对于各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P≤0.05作为评定差异有统计学意义的标准。利用Thermo Xcalibur软件解析其化合物，鉴定时，综合对比化合物的归属、母离子、子离子的信息，并参考相关研究的文献，确定化合物的结构。

3 结果

3.1 开心散(KXS)提取物对大鼠焦虑行为的影响

高架十字迷宫结果显示，与模型组比较，阳性组地西泮能增加大鼠在高架十字迷宫的开臂时间OE%值(P<0.05)，表明造模成功。与模型组比较，开心散提取物高剂量组(12 g/kg)和中剂量(6 g/kg)能增加大鼠在高架十字迷宫的开臂时间OE%值(P<0.05)，显示出开心散提取物高剂量、中剂量对大鼠的抗焦虑作用，尤其以开心散提取物高剂量的抗焦虑作用更为明显。与对照组相比，开心散提取物低剂量组(3 g/kg)开臂时间百分比也增加，但没有统计学意义。此外，与对照组相比，地西泮和KXS提取物(12、6和3 g/kg)能够显著提高大鼠的开臂次数(P<0.05)。同时，表明KXS具有明显的剂量效应关系，见表1。

旷场实验结果显示，与模型组比较，地西泮能提高大鼠进入旷场中央区域的距离OD%值(P<0.05)，表明造模成功。与模型组比较，开心散提取物组能增加大鼠在中心区域的距离OD%值，但没有统计学差异，见表1。

3.2 大鼠海马5-HT检测结果

5-HT检测结果显示，与模型组比较，地西泮组与开心散给药组(3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg)能够显著升高大鼠脑内神经递质5-HT的含量，尤其高、中剂量组的升高程度最显著(P<0.01)，并呈剂量依赖性，见表1。说明开心散提取物组能够显著提高焦虑模型大鼠脑内神经递质5-HT的含量，证实其具有较好的抗焦虑作用。

表1 开心散干预大鼠焦虑模型情况比较

3.3 开心散提取物的成分分析

通过摸索得到的洗脱条件，建立了开心散提取物在254 nm下的色谱图(见图1)以及UPLC-DAD-ESI-MSn总离子流图(见图2)。根据质谱裂解信息以及文献对比[12-15]，共解析图谱得到39个化合物，包括11个远志皂苷类化合物，12个远志寡糖酯类化合物，3个蔗糖酯化合物，3个远志酮化合物，3个人参皂苷类化合物，7个三萜烯酸类化合物，分别为西伯利亚糖A5、西伯利亚糖A1、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、sibiricaxanthone A、7-O-methylmangiferin、polygalaxanthone Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、Tenuifoliose L、Tenuifoliose F、Tenuifoliose K、Tenuifoliose C、Tenuifoliside C、Tenuifoliose J or I、Tenuifolise B、Tenuifoliose H、Tenuifoliose A、Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Ro、Ginsenoside Rd2、Senegin IV、Onjisaponin O、Onjisaponin L、Senegin Ⅲ、Onjisaponin R、Polygalasaponin XXXⅡ、Onjisaponin E、Onjisaponin F、onjisaponin G、onjisaponin Gg、onjisaponin W、poricoic acid H、3β-p-hydroxybenzoyldehydrotumulosic acid、16α-hydroxytrametenolic acid、tumulosic acid、poricoic acid C、3β-hydroxy-16α-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、3-epi-dehydropachymic acid。

图1 开心散提取物的UPLC色谱图

图2 开心散提取物UPLC-MS-MSn总离子流图

4 讨论

开心散始载于唐代孙思邈的《备急千金要方》，用于治疗失眠，精神障碍和病态健忘。研究表明，开心散可以通过增加MT1表达和增加BDNF表达来改善抑郁样行为[16]。然而，开心散提取物抗焦虑作用以及机制研究尚未阐明。本课题选用被广泛用于评估啮齿动物焦虑相关行为的高架十字迷宫和旷场实验作为评价指标，结果表明开心散提取物(12 g/kg和6 g/kg)改善了焦虑样行为，表现为能够显著增加大鼠在高架十字迷宫的开臂时间百分比和开臂次数(P<0.05)，以及能够相应增加大鼠在旷场实验的中央区域距离。此外，开心散提取物(12 g/kg，6 g/kg和3 g/kg)可以显著上调海马5-HT水平(P<0.05)，并呈剂量依赖性。长期以来，5-羟色胺(5-HT)系统参与了焦虑的调解，5-HT也是现有抗焦虑药物的主要目标[17]。总之，KXS提取物可能通过其5-羟色胺(5-HT)系统改变了这些行为障碍而具有抗焦虑作用。

为了探索开心散提取物的药效成分，笔者建立了UPLC色谱图。在此基础上，笔者进一步通过UPLC-DAD-ESI-MSn并对比相关文献，鉴定了39个化学成分，包括11个远志皂苷类化合物，12个远志寡糖酯类化合物，3个蔗糖酯化合物，3个远志酮化合物，3个人参皂苷类化合物，7个三萜烯酸类化合物。在先前的研究基础上[12]，笔者进一步鉴定出7种三萜酸。原因可能是本研究中开心散提取物是用60%乙醇提取的，而三萜酸更易被提取。此外，据报道人参皂苷和远志皂苷等具有抗焦虑作用或抗抑郁作用[18]。