李先民 卜朝阳 李春牛 崔学强 黄莉萍 卢家仕 黄展文 苏群

摘要：为明确不同处理对杜鹃红山茶愈伤组织诱导的影响，以8年生杜鹃红山茶为材料，研究不同外植体材料、灭菌方式、培养基种类、激素种类及配比、活性炭浓度等对杜鹃红山茶愈伤组织诱导的影响。结果表明：（1）在相同的灭菌方式下，叶片外植体愈伤诱导率均明显高于叶柄外植体和花瓣外植体。采用0.1% HgCl2灭菌5 min，叶片外植体愈伤诱导率最高，达48.89%。（2）MS培养基是最适合叶片和花瓣外植体愈伤组织诱导的基本培养基，叶片和花瓣在该培养基中的愈伤诱导率均最高，分别达42.12%、37.62%。（3）培养基中添加不同浓度的6-BA与GA3对叶片外植体愈伤诱导率具有显著影响，低浓度的6-BA和高浓度的GA3有利于提高愈伤诱导率，愈伤诱导率最高的激素组合为1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3，诱导率达61.67。（4）外植体褐化率随添加活性炭浓度的增加呈逐渐降低的趋势，添加活性炭浓度为1.2 g/L时，叶片和花瓣外植体褐化率最低且愈伤诱导率处于最高水平。

关键词：杜鹃红山茶;愈伤组织诱导;外植体;灭菌;培养基;激素

中图分类号：S685.140.4+3  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）23-0061-05

收稿日期：2021-06-22

基金项目：广西科技基地和人才专项（编号：桂科AD18281004）;广西农业科学院基本科研业务专项（编号：桂农科2017YM47）;广西农业科学院科技先锋队专项（编号：桂农科JZ2020013）;广西农业科学院科技发展基金（编号：桂农科2021JM29）。

作者简介：李先民（1988—），男，广西南宁人，硕士，助理研究员，主要从事观赏植物栽培与育种研究。E-mail：lixm7406@126.com。

通信作者：李春牛，硕士，副研究员，主要从事观赏植物选育及栽培研究。E-mail：lichunniu@126.com。

杜鹃红山茶（Camellia azalea）为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）常绿灌木或小乔木，是中国特有珍稀濒危物种，现存野生植株仅1 000多株，仅在广东省阳春市鹅凰嶂省级自然保护区内一个狭窄的河谷两旁有零星分布[1]，已被《中国物种红色名录》列为极危种[2]。杜鹃红山茶花期长，夏、秋2季为盛花期，在适宜的栽培条件下一年四季都可以开花，是迄今为止发现的唯一能真正全年开花的山茶物种，弥补了山茶属夏季和秋季不开花的空白[3]。杜鹃红山茶开花稠密、花朵大而艳红，叶形奇特、叶厚革质，植株紧凑，病虫害少，适应性强，在园林与观赏园艺方面具有广阔的应用前景[4];同时，杜鹃红山茶是培育杂交四季茶花优良品种的宝贵亲本材料，具有极高的科研价值[5]。

近年来，随着杜鹃红山茶知名度及市场需求与日俱增，国内外关于杜鹃红山茶繁殖技术的研究也逐渐增多，主要集中在扦插繁殖[6]、嫁接繁殖[7]、播种育苗[8]方面，有关组织培养的研究较少。利用组织培养，可以生产大量的优良无性系[9]，将植物组织培养技术应用于杜鹃红山茶的快速繁殖，对种质资源保护，丰富园林植物多样性，缓解杜鹃红山茶苗木供应紧张的状况，为科研提供优良无性系，皆具有十分重要的意义。本研究以杜鹃红山茶叶片、叶柄及花瓣作为外植体，研究不同外植体材料、灭菌方式、培养基种类、激素种类及配比、活性炭浓度等对杜鹃红山茶愈伤组织诱导的影响，探索提高杜鹃红山茶愈伤组织诱导效果的技术方法，旨在为杜鹃红山茶组织培养提供理论依据，以期为其他同类型林木组织培养技术的研究提供经验和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于广西农业科学院花卉研究所组培中心。组织培养室培养温度为（25±2） ℃，光照度为3 000 lx，光照时长为12 h/d。

1.2 试验材料

试验材料采自广西农业科学院花卉研发与推广中心山茶资源圃生长健壮的8～9年生杜鹃红山茶植株，以成熟叶片、成熟叶片的叶柄、花瓣（选择花苞，剥去外部受损花瓣，采用由外至内第3～4层花瓣）3种材料作为外植体。在碟子上将叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的块状，叶柄剪成约0.5 cm的小段，将花瓣剪成0.5 cm×0.5 cm的块状。

1.3 试验方法

1.3.1 不同外植体及灭菌方式 试验于2020年6月进行，以叶片、叶柄、花瓣作为外植体材料，先用75%乙醇棉球擦洗外植体表面，饱和洗衣粉水洗涤，再用流水冲洗15～20 min，在超净工作台上用75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次后，进行灭菌处理，灭菌剂采用0.1% HgCl2（氯化汞）或10% NaClO（次氯酸钠），0.1% HgCl2设置5、7、10 min 3个灭菌时间，10% NaClO设置10、15、20 min 3个灭菌时间，共6个灭菌处理，灭菌处理后用无菌水清洗5～6次。处理完成接种于MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）培养基中，各处理接种15瓶，每瓶3个外植体，重复3次。培养50 d后统计外植体愈伤诱导率及污染率。

1.3.2 不同外植体及培养基 试验于2020年6月进行，以叶片、花瓣作为外植体材料，先用75%乙醇棉球擦洗表面，饱和洗衣粉水洗涤，再用流水冲洗15～20 min，在超净工作台上用75%的乙醇浸泡 30 s ，无菌水冲洗3次后，转入0.1% HgCl2中浸泡5 min，无菌水冲洗5～6次。在碟子上将叶柄剪成约0.5 cm的小段，叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的块状，花瓣除去最外层后，将花瓣剪成0.5 cm×0.5 cm 的块状，分别接入MS培养基（青岛海博）、B5培养基（青岛海博）、WPM培养基（青岛海博）及SH培养基（北京酷来搏）中，每种培养基均添加 1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。各處理接种15瓶，每瓶3个外植体，重复3次。培养50 d后统计外植体愈伤诱导率及褐化率。

1.3.3 不同激素处理 试验于2020年6月进行，以叶片作为外植体材料，按“1.3.2”节的方法灭菌，诱导培养基以MS为基本成分，添加3%蔗糖、0.4%琼脂，同时添加不同种类和浓度的激素，采用 L9（34） 正交设计方案（表1），设置6-BA浓度、NAA浓度及GA3浓度等3个因素，每个因素分别设3个水平，共9个激素组合处理，pH值5.8。各激素组合接种10瓶，每瓶2个外植体，重复3次。培养50 d后统计外植体愈伤诱导率。

1.3.4 活性炭防褐化试验 试验于2020年6月进行，以叶片、叶柄、花瓣作为外植体材料，按“1.3.2”节的方法灭菌，接入不同浓度处理的培养基中。培养基为MS+6-BA（1.0 mg/L）+ NAA（1.0 mg/L）诱导培养基，培养基中添加活性炭浓度设置4个水平，即0、0.4、0.6、1.2 g/L。每种处理接种15瓶，每瓶3个外植体，重复3次。培养50 d后统计愈伤诱导率和褐化率。

1.4 统计分析

采用Excel 2010软件进行数据统计，采用SPSS 21.0 软件进行方差分析和显著性检验（Duncans新复极差法）。

2 结果与分析

2.1 不同外植体及灭菌方式对愈伤组织诱导的影响

不同外植体及灭菌方式对杜鹃红山茶愈伤组织诱导率及污染率的影响见表2，不同处理间杜鹃红山茶外植体愈伤诱导率及褐化率的差异均达到了显著水平。选择叶片作为外植体，采用0.1% HgCl2灭菌5 min，外植体诱导愈伤诱导率最高，达48.89%，与选择叶片作为外植体的其他处理以及T13、T14、T16相比差异不显著（P>0.05），但显著高于其他处理。选择叶片作为外植体，在相同的灭菌方式下，其愈伤诱导率均明显高于采用叶柄和花瓣作为外植体。选择叶柄作为外植体，采用10% NaClO灭菌10 min，外植体褐化率最高，达61.90%，与选择叶柄作为外植体的其他处理以及T4相比差异不显著（P>0.05），但显著高于其他处理。选择叶柄作为外植体，在相同的灭菌方式下，其褐化率均明显高于采用叶片和花瓣作为外植体。

2.2 不同外植体及培养基对愈伤组织诱导的影响

不同外植体及培养基对杜鹃红山茶愈伤组织诱导率及褐化率的影响见表3，不同处理间杜鹃红山茶外植体愈伤诱导率及褐化率的差异均达到了显著水平（P<0.05）。各处理中，选择叶片作为外植体，接种于MS培养基上，愈伤诱导率最高，达4212%，愈伤诱导率显著高于接种于其他培养基上的叶片，但与花瓣接种于MS、B5及SH培养基相比差异不显著。选择叶片作为外植体，接种于B5培养基上，外植体褐化率最高，达68.75%，显著高于其他处理，其他处理间褐化率差异不显著，褐化率最低的处理为T3，即选择叶片作为外植体，接种于WPM培养基上，褐化率为31.67%。

2.3 不同激素处理对愈伤组织诱导的影响

从表4可以看出，愈伤诱导率最高的处理为激素组合3，即1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3，发芽率达61.67%，与组合5相比愈伤诱导率差异不显著，显著高于其他处理组合（P<0.05）。

方差分析（表5）表明，6-BA浓度与GA3浓度对杜鹃红山茶叶片愈伤诱导率的影响达到显著水平（P<0.05）。从图1可以看出，随着6-BA浓度的增加，愈伤诱导率呈逐渐降低的趋势;随着GA3浓度的增加，愈伤诱导率呈逐渐升高的趋势。NAA浓度对杜鹃红山茶愈伤诱导率的影响不显著（P>0.05），但较高浓度的NAA可提高叶片愈伤诱导率。极差分析结果表明，本试验设置的3个因素对发芽率的影响由大到小排列为GA3浓度>6-BA浓度>IAA浓度，就愈伤诱导率而言A1B3C3组合为最佳组合，即采用添加了1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3的MS培养基诱导愈伤组织效果最佳，该组合与实际观测的最优组合（处理组合3）一致。

2.4 活性炭对愈伤组织诱导及防褐化的影响

不同活性炭浓度对杜鹃红山茶愈伤组织诱导率及褐化率的影响见表6，不同处理间杜鹃红山茶外植体愈伤诱导率及褐化率的差异不显著。选择叶片作为外植体，添加活性炭浓度为1.2 g/L时，愈伤诱导率最高且褐化率最低，分别为40.39%、2056%，但愈伤诱导率和褐化率与其他处理相比差异不显著。选择叶片或花瓣作为外植体，随着添加活性炭浓度的增加，外植体褐化率均呈逐渐降低的趋势。

3 讨论与结论

外植体类型会影响愈伤的诱导[10]，同种植物不同部位的组织，其再生能力存在较大差别，因此对外植体的筛选也是组织培养中的关键技术。本试验中，选择杜鹃红山茶叶片和花瓣作为外植体，在相同的灭菌方式下，其愈伤诱导率均高于叶柄，褐化率均低于叶柄，这可能是由于叶柄基部抱茎，夹带有较多杂菌，且外形不规整，不易被消毒清洗彻底，结合实际观察，叶柄作为外植体接种后褐化率较高，导致其难以形成愈伤组织。同时，考虑组织培养生产的无菌叶片数量上要多于叶柄及花瓣，因此，叶片更适合作为外植体加以使用。本试验中，随着灭菌剂灭菌时间的延长，叶片及花瓣的愈伤诱导率及褐化率均逐渐降低，这可能是因为消毒时间适当延长可以降低污染，但是会伤害到外植体组织，导致外植体死亡率升高[11]。结合实际观察，选择叶片作为外植体，采用0.1% HgCl2灭菌5 min，出现愈伤组织时间较快，最有利于愈伤组织诱导。

本研究表明，培养基的种类对愈伤组织的诱导率及愈伤组织的质量存在显著影响，这与不同培养基的组成差异较大，对杜鹃红山茶外植体细胞的生长产生了不同的影响有关[12]。本试验中，叶片外植体接种于MS培养基的愈伤诱导率最高，叶片及花瓣外植体接种于MS培养基的愈伤诱导率均高于接种于其他3种培养基。结合实际观察，就叶片而言，接种于MS培养基较其他培养基形成愈伤组织快，数量多，质地均匀致密，为黄绿色，愈伤组织质量较好，生长能力更强，更接近与胚性愈傷组织，说明MS培养基能充分提供杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长所需养分，是最适合杜鹃红山茶愈伤组织诱导的基本培养基。

植物激素是植物愈伤组织诱导分化的关键性因素[13]，外源激素起着传递遗传物质的脱分化、再分化等发育信号的作用[14]，激素种类及浓度是影响胚性愈伤组织诱导的关键因子之一[15-16]，本试验选择的3种激素中，6-BA浓度与GA3浓度对杜鹃红山茶叶片愈伤诱导率影响显著，NAA浓度对杜鹃红山茶愈伤诱导率的影响不显著;随着6-BA浓度的增加，愈伤诱导率呈逐渐降低的趋势，随着GA3浓度的增加，愈伤诱导率呈逐渐升高的趋势。可以认为杜鹃红山茶外植体在诱导愈伤组织阶段对6-BA浓度与GA3浓度反应敏感，外植体要求较低的6-BA浓度水平及较高的GA3浓度水平。试验通过多重比较得出理论上最佳组合为A1B3C3，与实际观测的最优组合一致，在今后的试验中可以以这一组合为参考，在此基础上进一步调整细化6-BA及GA3的配比，以达到更为理想的愈伤组织诱导效果。

山茶科植物中酚类物质含量较高[17]，当酚类化合物含量高时，木质素、单宁或色素形成就多，酚类物质易经氧化形成醌类物质，导致褐变的发生[18]，褐化现象是制约愈伤组织生长、增殖和分化的主要因素[19]。在培养基中添加适宜浓度的防褐化剂可有效地抑制褐化[20]。本试验中，随着添加活性炭浓度的增加，外植体褐化率呈逐渐降低的趋势，与吕宗友等的研究结果[21-22]一致，说明在培养基中添加适宜浓度活性炭对外植体褐化有较好的控制效果，且能有效提高愈伤诱导率，这可能是采用活性炭等酚类吸收剂从根源上阻断了褐化这一系列化学反应，本试验中添加活性炭浓度为1.2 g/L时，叶片和花瓣外植体褐化率最低且愈伤诱导率处于最高水平，是最为适合的活性炭添加浓度。

杜鹃红山茶愈伤组织诱导宜选择叶片作为外植体。就叶片外植体而言，采用0.1% HgCl2灭菌 5 min 灭菌效果最佳;接种于MS培养基上形成愈伤组织快，愈伤组织质量好;在MS培养基中添加低浓度的6-BA及高浓度的GA3有利于提高愈伤诱导率，添加1.2 g/L活性炭，能有效防止外植体褐化。

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