王财金 弟文静 马淑梅 王 洋

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，150080，黑龙江哈尔滨）

大豆灰斑病（Cercospora sojina）于1921年在我国首次发现后，在国内各大豆种植区均有不同程度的发生，并且在我国北方春大豆产区发生最为严重，直接导致大豆品质降低，产量损失超过60%[1]。大豆灰斑病病菌为半知菌亚门真菌，具有明显的生理分化现象，如Pham等[2]用16个鉴别寄主鉴定出11个生理小种；Mian等[3]用10个鉴别寄主鉴定出22个生理小种；丁俊杰等[4]用6个鉴别寄主鉴定出15个生理小种。我国的灰斑病1号生理小种是北方春大豆产区的第一优势小种[5]，2006-2010年黑龙江省大豆灰斑病生理小种的检测结果表明，其在各大豆主产区出现频率最高，为50.5%，平均为40.1%[6]。

选育抗病品种是防治大豆灰斑病的有效方法。利用分子技术了解不同等位基因的作用，高效利用不同种质资源的有益等位基因，在常规育种或分子育种中有目的地聚合或替代，甚至可以通过分子设计提高育种效率[7]。以群体连锁不平衡为基础的关联分析是发掘携带优异等位变异和载体材料的定位方法。在大豆抗病性研究中，Sun等[8]利用SSR标记通过关联分析鉴定了与大豆疫霉抗性相关的4个抗性位点；魏崃等[9]利用150份大豆品种与256对SSR标记进行关联分析找到差异显著的关联等位变异位点12个，获得了对每个小种具有不同抗性的大豆材料；冯莉君[10]利用300份种质资源对大豆胞囊线虫4号生理小种的鉴定发现了1个新抗源，关联分析发现了与之相关联的4个连锁标记。

目前，对大豆灰斑病抗性位点发掘的研究较少，主要有两种途径。一种是利用家系作图群体，张文慧等[11]发现SSR标记Satt565、SOYGPATR和Satt396与灰斑病1号生理小种抗性位点紧密连锁，董伟等[12]检测到3个RAPD标记与灰斑病1号生理小种抗性位点紧密连锁；另一种是利用自然群体，董亚楠等[13]发掘到7个与大豆灰斑病12号生理小种抗性位点相关联的SSR标记，分别是Satt052、Satt335、Satt557、Sat_368、Sat_346、Satt243 和Sat_151。

本研究以205份大豆种质资源为试验材料，通过人工接种灰斑病1号生理小种进行抗性鉴定，利用117对SSR标记发掘大豆资源中抗灰斑病1号生理小种的优异等位变异和携带优异等位变异载体材料，为培育抗灰斑病品种提供遗传信息和理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取黑龙江省育成大豆品种96份、外省育成大豆品种34份、地方大豆品种13份和野生大豆资源62份为供试材料（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆品种灰斑病病情指数鉴定 用从大豆病粒上分离出的大豆灰斑病1号生理小种配制浓度为1×105孢子/mL的孢子液，在苗期（2片复叶展开期）利用喉头喷雾器接种，将菌液喷在2片复叶上，每盆接种3mL菌液，接种2遍[14]。将保湿罩罩在接种后的幼苗上，保湿48h后将其拿掉，在温度26℃、相对湿度40%条件下培养2周后调查发病情况，2次重复。灰斑病病情指数鉴定标准参考马淑梅[15]的方法。按照大豆灰斑病抗病程度分级标准（表2），计算病情指数，病情指数（%）=∑（病级株数×代表数值）/株数总和×发病最重级代表值×100。

表1 不同来源的205份大豆资源Table 1 A total of 205 soybean resources of different origins

表2 大豆灰斑病鉴定分级标准Table 2 Cercospera sojina identification grading criteria

1.2.2 DNA提取及SSR引物筛选 利用大豆幼苗期嫩叶，采用改良的CTAB法提取DNA[16]。将DNA浓度稀释至100ng/μL备用。从大豆基因库（https：//www.soybase.org）选取117对SSR标记（图1），SSR标记由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增及电泳 PCR扩增为10μL反应体系，含 1.0μL buffer、0.2μL 的 dNTP、1.5μL 的正反SSR引物、0.1μLTaq聚合酶、1.5μL的DNA模板和5.7μL的去离子水。PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，42℃～61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。反应产物于4℃保存。PCR扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶中分离，采用银染法[17]显色。

1.3 数据分析

1.3.1 遗传多样性及群体结构 利用PowerMarker version 3.25软件[18]计算117对SSR标记的等位基因数、基因多样性和多态信息含量（PIC）。基于Bayesian模型，利用Structure 2.2软件[19]对205份大豆资源进行群体结构分析，将亚群数目（K）设置为1～9，Markov Chain Monte Carlo（MCMC）开始时的不作数迭代长度（length of burn-in period）设为10 000次，再将不作数迭代后的MCMC设为100 000次，各独自运行5次计算Q值。依据似然值最大原则选取合适K值，如果出现LnP(D)随群体数增加而增加，无法确定最适亚群数情况，则通过计算ΔK来确定K的最优亚群数[20]。

图1 117对SSR标记在大豆染色体上的分布Fig.1 Distribution of 117 SSR markers on the chromosomes of soybean

1.3.2 聚类热图 采用NTSYS 2.0软件计算205份大豆资源的遗传相似性系数（genetic similarity，GS），以材料间的遗传距离（genetic distance，GD）（GD=1-GS）为基础，运用MeV软件的层次聚类法（hierarchical clustering）对205份大豆资源群体进行聚类热图分析。

1.3.3 关联分析及优异等位变异确认 利用Tassel 3.0软件[21]中一般线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）分别进行性状-标记的关联分析。将Q值作为协变量、SPAGeDi-1.3软件[22]计算出来的亲缘关系值矩阵作为随机变量，利用标记分别对大豆灰斑病抗性表型值逐一进行回归分析，选取显著性P＜0.05和表型变异解释率R2＞0.05的位点。依据Bradbury提出的计算公式来确定优异等位变异位点，表型效应值分析参考文自翔等[23]的方法。

2 结果与分析

2.1 灰斑病1号生理小种抗性鉴定分析

205份大豆资源对灰斑病1号生理小种的抗性鉴定结果（表3）表明：高抗资源1份，占供试材料0.49%；抗病资源40份，占供试材料19.51%；中抗资源100份，占供试材料48.78%；感病资源63份，占供试材料30.73%；高感资源1份，占供试材料0.49%。病情指数变化范围12%～82%，其中地方品种青扎豆的病情指数最高（82%），黑龙江育成品种东农43的病情指数最低（12%）。病情指数总平均值为54.16%，平均变异系数为20.90%。

表3 不同来源大豆资源抗性鉴定结果Table 3 Resistance identification results of different origin soybean resources

从表3发现，病情指数在4种不同来源的群体中存在差异，地方品种（C）变异系数最大（24.87%）；外省育成品种（B）变异系数最小（9.61%）。从4种不同来源群体病情指数平均值可以看出，黑龙江育成品种（A）和野生资源（D）抗病性相对较好，外省育成品种（B）和地方品种（C）抗病性较弱。

2.2 SSR位点遗传多样性分析

117对SSR标记均具有多态性，在全部大豆资源中共检测出1 420个等位变异，不同位点的等位变异数变幅为5～19，平均每对SSR标记的等位变异数为 12.14。标记 Satt142、Satt449、Satt341、Satt534和Sat_390的等位变异数最多，为19个；Sat_317、Satt332、Satt291和Sat_087的等位变异数最少，为5个。基因多样性变幅在0.14～0.88之间，平均为0.74；多态性信息含量（PIC）变幅在0.13～0.86之间，平均为0.72。

2.3 亲缘关系值分析

利用SPAGeDi-1.3软件计算两两材料间亲缘关系值频率分布（图2）。两两材料间的亲缘关系值小于0.05的占64.07%，0.05～0.10的占4.29%，0.10～0.15的占7.40%，0.15～0.20的占6.77%，大于0.50的占0.49%，表明205份大豆材料间亲缘关系值普遍偏低，群体间亲缘关系较远。

2.4 群体结构

利用Structure 2.2软件对205份大豆材料进行群体结构划分。LnP(D)值随着K值的增大而增大（图3-A），选用ΔK来计算，当K=3时，ΔK峰值最明显（图3-B）。因此，将材料分为3个亚群（图3-C），第1亚群（Pop1）有100份材料，包括96份黑龙江省育成品种和4份外省育成品种；第2亚群（Pop2）有43份材料，包括外省育成品种30份和地方品种13份；第3亚群（Pop3）有62份材料，全为野生资源。

2.5 热图分析

运用MeV软件的层次聚类法对205份大豆资源进行聚类热图分析（图4）。结果显示，按照遗传距离的大小，205份大豆资源被明确的分为3个亚群（Pop1、Pop2和Pop3），分析结果与利用Structure 2.2的群体分析结果一致。

图2 205份大豆资源的亲缘系值分布图Fig.2 Distribution of relative kinship value of 205 soybean resources

图3 205份大豆资源的群体结构Fig.3 Population structure of 205 soybean resources

2.6 关联分析

利用Tassel 3.0软件中的GLM（Q）和MLM（Q+K）程序进行关联分析（表4）。GLM共检测到7个与大豆灰斑病1号生理小种抗性关联的标记，分布在6条染色体上，表型变异解释率范围在7.58%～16.06%，其中Satt142、Satt431和Satt244对表型变异解释率超过10.00%；MLM只检测到1个与大豆灰斑病1号生理小种抗性关联的标记Satt332，且与GLM模型检测的表型变异解释率一致（9.17%）。

图4 205份大豆资源聚类热图分析结果Fig.4 Cluster heat map analysis results of 205 soybean resources

表4 与抗性显著相关的位点及其表型变异解释率Table 4 Marker loci associated with resistance and their explained phenotypic variation

2.7 优异等位变异及载体材料

通过对大豆灰斑病1号生理小种抗性显著关联的7个SSR位点进行表型效应值分析（表5）。结果表明，具有增效的效应值大于20的等位变异分别为Satt244-230（效应值26.16），典型载体材料为12C8646；Satt142-154（效应值 21.94），典型载体材料为12C8670；Satt244-186（效应值20.19），典型载体材料为12C6175。携带上述3个等位变异的材料均为野生资源。全部育成品种中携带的增效效应值最大的等位变异为Satt142-189（效应值8.94），共有8个材料携带此等位变异，其中1个为野生资源，其余7个均为黑龙江省育成品种，分别为东农43、东农47、合丰45、黑河20、黑河26、黑河43和绥农25。

表5 与抗性显著关联的位点其增效等位变异对应的表型效应Table 5 Phenotypic effect of some positive alleles at loci significantly associated with resistance

3 讨论

大豆灰斑病在北方大豆主产区常有发生，灰斑病1号生理小种是黑龙江省产区的优势生理小种，对大豆产量和品质危害较大。在生产调查中发现，灰斑病的发生与品种关系密切，在发病较重的地区推广种植抗灰斑病的品种较少，大部分为中感至感病品种，甚至还有一些高感品种。因此，培育和推广抗灰斑病大豆品种是减少病害损失的有效途径之一。

我国在20世纪80年代开始抗灰斑病大豆品种的选育工作，利用常规育种方法培育了一批具有抗性的品种。随着分子标记技术的发展，对重要农艺性状关联标记的发掘为分子标记辅助选择育种提供了遗传信息，但对灰斑病抗性基因的相关发掘研究不多，对灰斑病1号生理小种抗性遗传分析只有张文慧等[11]利用家系作图群体进行过报道，并在4号染色体上找到了3个与抗性基因连锁的标记，连锁顺序和连锁距离为Satt565-6.2cM-SOYGPATR-6.5cM-Hrcs1-14.7cM-Satt396。

本研究以黑龙江省育成品种、地方品种和野生资源构建关联群体，进行了灰斑病1号生理小种抗性的相关研究，发现大豆资源对灰斑病1号生理小种抗性具有较为广泛的遗传变异；检测到7个与抗性位点关联的分子标记，其中位于12号染色体上的Satt142对表型变异的解释率最大（16.06%）；在本研究中检测到与抗性位点关联的Satt244，其与品种Davis携带的抗多个生理小种的Rcs3基因[24]相关联。在发掘到的36个优异等位变异中增效效应值大于20的等位变异有3个，都存在于野生资源中。育成品种中增效效应值最大为8.94，分布在7个黑龙江育成品种中，其中东农43检测到7个具有增效效应的等位变异，表型效应变幅在0.32～8.94。在地方品种中分布的增效效应值均较小。由此推测，野生资源通过长期自然选择，群体中保留了抗灰斑病的基因；而地方材料没有进行过更多的选择，群体的抗病性较弱。

目前，关于灰斑病1号生理小种抗性的遗传分析报道较少，本研究发掘到的抗灰斑病1号生理小种7个SSR标记位点及具有增效表型值的等位变异和载体材料可为培育抗灰斑病1号小种品种提供遗传信息。

4 结论

检测到与灰斑病1号生理小种抗性显著关联的SSR位点7个，分别为Satt142、Satt431、Satt244、Satt332、Satt233、Satt387和 Satt309，其中Satt142对表型变异的解释率最大，为16.06%。对灰斑病1号生理小种抗性具有增效作用的等位变异有36个，野生资源中效应值较大的3个等位变异分别为Satt244-230、Satt142-154和Satt244-186，3个典型材料分别为12C8646、12C8670和12C6175；育成品种中具有最大增效值的等位变异为Satt142-189（8.94），典型载体材料为东农43。