何雪冬， 王 娴

(1.解放军第一四九医院， 江苏 连云港 222042 2.江苏省连云港市第一人民医院， 江苏 连云港 222002)

瘢痕疙瘩是皮肤伤口愈合或者由不明原因导致皮肤损伤愈合后形成的过度生长的异常瘢痕组织，临床表现为瘢痕疙瘩成纤维细胞大量异常增殖，真皮结缔组织发生纤维化[1]，出现疼痛、瘙痒等症状，不仅影响美观，还影响患者正常生活，一般发生于易感个体皮肤损伤引起的异常伤口愈合反应[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小的、非编码内源性RNA分子，由18～25个核苷酸组成，可以通过转录后降解目标信使RNA(mRNA)或通过与3 '端非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)结合来抑制其翻译，从而在转录水平上调节基因表达，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等生理活动[3]。据报道，miRNA-23b在造血干细胞的产生及分化中起重要作用[4]，并有报道称下调miRNA-23b-3p，可调控苦瓜蛋白高表达，降低胞内脂质积累[5]。notch1蛋白主要在细胞质和细胞核中表达，可能在瘢痕癌的形成中发挥作用[6]。本研究通过检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-23b和notch1蛋白的表达量，探究二者间作用关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1临床资料:收集2017年12月至2019年11月在解放军第一四九医院就诊的瘢痕疙瘩患者130例，手术过程中取每位患者瘢痕组织及周围正常真皮组织。所有患者经临床和病理确诊后，均排除恶性病变。根据瘢痕疙瘩的严重程度将其分为轻度65例、中度43例及重度22例。纳入标准：①皮肤损伤超过原有损伤范围并侵犯周围正常皮肤；②经手术切除后又复发者；③瘢痕病程超过6个月无痊愈者。只要符合其中一项即可纳入研究。排除标准：①妊娠或哺乳期妇女；②凝血功能异常者；③有肿瘤病史；④临床资料不完整。本研究经解放军第一四九医院伦理委员会批准；患者均签署知情同意书。

1.2主要仪器及试剂:CFX96型实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-RAD公司；DMi8型倒置显微镜购自德国徕卡公司。DMEM培养基(批号：KL-P0032)购自上海康朗生物科技有限公司；Trizol试剂盒(批号：ALH011-TUH)、反转录试剂盒(批号：ALH266-PTO)购自北京百奥莱博科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒(批号：SQ-13397)购自美国UNIBIOTEST公司；鼠抗人notch1单克隆抗体(批号：MAB11063)购自艾美捷科技有限公司；兔抗鼠IgG多克隆抗体(批号：C1707)购自北京普利莱(APPLYGEN)基因技术有限公司。

1.3方 法

1.3.1瘢痕疙瘩及正常真皮组织中成纤维细胞的提取、培养:将收集的瘢痕疙瘩组织标本剪碎后，加入3mg/mLⅡ型中性蛋白酶于4℃下隔夜消化，弃去上皮；将正常真皮组织标本剪碎后加入Ⅰ型胶原酶，于37℃恒温箱中消化2h，之后加入Dnase Ⅰ终止液终止消化。将悬浮液于4℃下，2000r/min离心15min，弃去上清液，重悬细胞，再经过滤、离心后加入10mL DMEM增殖培养液悬浮，接种至培养瓶中培养，利用倒置显微镜观察细胞形态。

1.3.2实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)技术检测miR-23b水平:利用qRT-PCR技术检测瘢痕疙瘩及正常真皮组织成纤维细胞中miR-23b水平。用Trizol试剂盒提取总RNA，注意防止RNA酶污染。反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均严格按照说明书操作步骤执行，以U6为内参基因。循环参数：95℃，预变性3min；90℃，变性25s；60℃，退火20s；75℃，延伸40s，共40个循环。引物序列由生工生物工程公司合成，miR-23b上游引物：5'-CTTCCTAGGGGATTTCAG-3'，下游引物：5'-GCCCCACAGGAACAAGTCC T-3'；U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAA-3'，下游引物：5'-GGAACGCTTCACGA ATTTG-3'。用2-△△Ct法计算miR-23b相对表达量。

1.3.3免疫组化法检测notch1蛋白水平:采用免疫组化法检测notch1蛋白水平，所有组织标本经4%福尔马林溶液固定，脱水后侵蜡包埋，凝固后切片4μm，每个标本切2片，操作步骤严格按照试剂盒说明书执行。Notch1蛋白阳性结果以染色为淡黄色或黄棕色为主，根据阳性细胞所占比例及细胞染色强度综合评分进行半定量分析[7]。根据阳性细胞所占观察细胞的比例评分：<25%记为1分，25%≤阳性细胞比例<50%的记为2分，50%≤阳性细胞比例<75%的记为3分，≥75%的记为4分；根据细胞染色强度评分：无染色的记为0分，染色为淡黄色的记1分，染为黄色的记3分，染成黄棕色的记4分。将两组结果作乘积，总分<3分定义为阴性，≥3分定义为阳性。

2 结 果

2.1一般资料分析:瘢痕疙瘩患者130例，其中男58例，女72例，男女比例1:1.24。年龄21～67岁，平均年龄(34.27±10.23)岁。病程最短3个月，最长28年。130例患者皮损单发者83(63.85%)例，多发者47(36.15%)例，有家族史者19(14.62%)例。130例瘢痕疙瘩患者共有203个皮损，其中胸部78(38.42%)个，肩背部59(29.07%)个，四肢40(19.71%)个，耳部13(6.40%)个，腹部8(3.94%)个，腰臀部5(2.46%)个。皮损累积面积为大瘢痕6例(4.61%)，中瘢痕57例(43.85%)，小瘢痕67例(51.54%)。

图1 Notch1在正常真皮组织(A)和瘢痕疙瘩组织(B)中的表达(HE染色，×400)

2.2miR-23b、notch1在正常组织和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中的表达比较:与正常真皮组织相比，瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中miR-23b mRNA水平、notch1阳性表达率均增加，差异有统计学意义(P<0.05)。由免疫组化染色，notch1主要在细胞质和细胞核中表达，在细胞膜中也稍有表达，见表1和图1。

2.3瘢痕疙瘩严重程度与miR-23b mRNA、notch1的表达关系:MiR-23b mRNA、notch1在瘢痕疙瘩不同临床分级之间表达差异有统计学意义(P<0.05)，且随瘢痕疙瘩病情加重，miR-23b mRNA水平及notch1阳性表达率呈上升趋势,见表2。

表1 miR-23b mRNA notch1蛋白在正常组织和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中的表达

表2 瘢痕疙瘩严重程度与notch1的表达关系

2.4瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中miR-23b和notch1表达关系:Pearson相关性分析结果显示，瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中miR-23b和notch1呈正相关(r=0.529，P<0.05)。从miRTarBase数据库中可得，miR-23b靶向notch1的表达，共有3段靶向序列，见图2、图3。

图2 miR-23b和notch1的表达关系

图3 miR-23b靶向notch1的表达序列

3 讨 论

瘢痕疙瘩是一种良性皮肤纤维增生性肿瘤，是由皮肤损伤后伤口异常愈合引起的，临床特征为细胞外基质过度增生，疤痕组织逐渐侵犯周围正常组织，直至超出原始创伤区域[8]，且疤痕不会随时间的推移而消退。瘢痕疙瘩的常用治疗方法有按摩、压力治疗、手术切除、放疗等单独或联合治疗[9,10]，但临床结果显示单一治疗的效果不如联合治疗。近年来，人们越来越多地关注miRNA对与瘢痕疙瘩的作用机制。有研究发现[11]，过表达miR-34a的瘢痕疙瘩成纤维细胞在p53等凋亡信号通路相关基因表达上存在差异，推测miRNA可能参与病变形成与修复之间的平衡。据报道，miR-23b-3p与细胞增殖、侵袭和凋亡有关，是许多癌症的诊断和预后的生物标志物，其通过表达下调促进癌细胞增殖，导致预后不良[12]。然而关于miR-23b在瘢痕疙瘩组织中的研究鲜有报道。Lyu等[13]通过miRNA芯片分析比较瘢痕疙瘩组织成纤维细胞和正常成纤维细胞的miRNA表达谱差异，结果发现有9种miRNA差异性表达，在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中显著上调的6种miRNA中包括miR-23b-3p。本研究结果显示，与正常真皮组织相比，miR-23b在瘢痕疙瘩组织中呈高表达状态，与上述结果一致，且随着患者病情加重，miR-23b相对表达量呈上升趋势，推测miR-23b可能与瘢痕疙瘩的形成有关。

研究表明，notch信号途径广泛存在于生物体中，在生物个体生长发育、细胞分化及增殖凋亡等生命活动中起重要调控作用[14]。有学者发现[15]，在鼻咽癌notch1敲除细胞中，notch1水平下调，细胞增殖、迁移和侵袭受到明显抑制，提示notch1可能成为鼻咽癌临床治疗的新靶点。另有报道称[6]，notch1在增生性瘢痕组织中高表达，阳性率为92.86%，说明notch1高表达促进角质细胞过度分化，促进增生性瘢痕的形成。本研究结果显示，与正常真皮组织相比，瘢痕疙瘩组织中notch1蛋白阳性率较高，差异有统计学意义，而且随着瘢痕疙瘩临床分级加重，notch1阳性表达率逐渐上升，提示notch1蛋白高表达可能促进成纤维细胞的增殖，参与瘢痕疙瘩的形成。另外，本研究发现miR-23b和notch1呈正相关关系，提示miR-23b和notch1可能对瘢痕疙瘩的形成均起到积极作用，但具体的作用模式尚不明确，有待进一步研究。

综上所述，与正常真皮组织相比，miR-23b和notch1在瘢痕疙瘩组织中均呈高表达，且二者呈正相关关系，可能同时参与瘢痕疙瘩的形成、发展过程，但其具体作用机制有待进一步研究。