李清华， 马志红 ， 李 立， 唐艳丽， 陈宝刚， 唐桂华

(河北省承德市中心医院耳鼻喉科， 河北 承德 067000)

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其中以鳞状细胞癌最为常见，约占96%～98%。近年来喉癌发病率呈明显上升趋势[1]。与其他头颈部鳞状细胞癌一样，喉部黏膜癌变的无限增殖也是以单克隆的方式进行[2]。目前喉癌的治疗主要有手术切除、放射治疗、化学治疗、生物治疗等，喉癌早期患者手术治疗效果好，但发展到中晚期，则需要行部分喉、3/4喉或全喉切除术，患者还要短期或终身佩戴气管套管，严重影响生活质量，且预后较差、死亡率较高。因此，我们需要根据喉鳞状细胞癌发病的分子机制发现、探索与其发生、发展及预后有重要意义的生物学标志物，以更全面的预测患者的预后。SLC7A11既是哺乳动物重要的抗氧化蛋白，也是N-和C-末端均位于细胞质内的12通道跨膜蛋白，并且不依赖钠的胱氨酸和谷氨酸的电中性转运体系统Xc由其与单跨膜蛋白SLC3A2共同组成的[3,4]。在维持细胞内外的谷胱甘肽氧化还原平衡中，SLC7A11一方面编码胱氨酸/谷氨酸xCT的转运载体，另一方面又特异性转运胱氨酸和谷氨酸，因此，起到了重要作用[5]。在肿瘤中已发现影响谷胱甘肽氧化还原循环平衡的转运体，而细胞毒性抗肿瘤治疗的主要靶向即为这些转运体，其中重要的转运蛋白即为SLC7A11。多篇国内外报道中SLC7A11已经证明参与多种肿瘤的发生,包括神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌及食道癌等。虽然这些研究表明SLC7A11在肿瘤的诊断、预后和治疗中有着重要的意义，但是SLC7A11在人类喉鳞状细胞癌中的作用及机制尚不明确。Ki-67是增殖性细胞核的标记物，代表细胞增殖水平，是恶性肿瘤增殖效率的反应指标，Ki-67的高表达又是细胞增殖活跃的重要标志。多数学者认为它与多种恶性肿瘤发展、转移、预后均具有相关性。国内有关于SLC7A11、Ki-67在喉癌组织的表达，但两者共同的报道鲜有。本研究主要是采用免疫组化SP法检测喉癌组织中SLC7A11、Ki-67的表达，探讨两者与喉癌患者预后、复发的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料:收集首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科2008年8月至2014年11月期间收治的喉癌患者117例(喉癌组)，均经纤维电子喉镜、CT、增强CT及术前活检、术后病理结果明确为原发性喉鳞状细胞癌，并且入院前未行放化疗及生物治疗，其中声门上型59例，声门型55例，声门下型3例。排除标准：合并其他恶性肿瘤，合并全身感染及严重肝肾功能不全。其中，男110例，女7例，年龄在35～76岁(≤65岁63例，>65岁54例，平均年龄57.8±9.4岁)；TNM分期(UICC2002)：其中T1、T2期86例，T3、T4期31例；有淋巴结转移13例，无淋巴结转移104例；有远处转移4例，无远处转移113例；组织分化程度：高分化58例，中分化49例，低分化10例。同期选择同院收治的声带息肉患者65例(对照组)，男56例，女9例，年龄在37～68岁(≤65岁45例，>65岁20例，平均年龄53.5±8.9岁)。喉癌组与对照组中性别构成χ2=3.222，P>0.05无统计学意义。年龄、病史经过χ2两组相差不显著，P>0.05，差异无统计学意义。两组性别、年龄具有可比性。本研究符合《赫尔辛宣言》，并经首都医科大学附属北京同仁医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均告知及签署知情同意书后纳入本次研究。

1.2SLC7A11、Ki-67表达及检测:均采用免疫组化SP法。取喉癌组和对照组手术病理标本，常规石蜡包埋，利用石蜡切片机予4μm厚连续切片。经恒温烤箱烤片干燥处理后，二甲苯及梯度浓度(100%、95%、75%)乙醇脱蜡脱水;3% H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶;后在枸橼酸缓冲液高温下通过压力锅进行抗原修复5 min，直至室温冷却。10%山羊血清封闭非特异性抗原，分别滴加多克隆抗体SLC7A11(1∶500)、滴加单克隆抗体Ki-67(1∶100)，用 PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜。第二日，滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、干燥、封片。光学显微镜下观察并读取切片结果。其判定标准为：SLC7A11与Ki-67的阳性染色分别定位于细胞膜和细胞核，都呈现棕褐色、棕黄色(图1)。在光学显微镜400倍视野下随机选取至少5个不同的代表性区域，计算阳性细胞所占比例。阳性细胞所占比例：<10%为0分，10%～25%为1分，>25%～75%为2分，>75%为3分。细胞染色强度:未见染色、弱(浅黄色)、中(棕黄色)、强(棕褐色)分别计0、1、2、3、4分，即颜色越深，计分越多。阳性表达=阳性细胞比例评分×染色强度得分乘积≥1。

图1 SLC7A11、Ki-67在喉癌组织中的表达(SP褐色×400)

1.3观察随访:117例患者均建立随访记录档案，每3个月至半年通过门诊或电话随访，追踪随访3～5年，了解并记录复发、预后及死亡情况，并统计3年复发率和5年死亡率。

1.4统计学方法:采用SPSS23.0统计软件对实验结果进行统计学分析。主要采用四格表χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1喉癌组合对照组SLC7A11、Ki-67阳性表达比较:喉癌组SLC7A11阳性表达64例(54.7%)，Ki-67阳性表达41例(35.0%)，对照组SLC7A11阳性表达20例(30.9%)，Ki-67阳性表达10例(15.34%)，两组SLC7A11、Ki-67阳性表达率比较有统计学意义(χ2分别为9.630、8.006，P<0.05)。

2.2喉癌组织中SLC7A11、Ki-67的阳性表达与临床病理特征关系:喉癌组中SLC7A11阳性表达与临床分期有关(P<0.05)，与淋巴结转移、远处转移、组织分化程度无关(P均>0.05)。喉癌组织中Ki-67阳性表达在不同的临床分期中有明显差异，临床分期愈晚，Ki-67阳性表达愈高(P<0.05)。而喉癌组织中Ki-67阳性表达与年龄、性别、远处转移、组织分化程度、淋巴结转移无关(P均>0.05)，见表1。

表1 喉癌组织SLC7A11 Ki-67阳性表达与患者临床病理特征的关系

表2 3年复发者SLC7A11和Ki-67表达情况

2.3SLC7A11、Ki-67在喉鳞状细胞癌中的表达与预后:本次研究117例喉癌患者中，术后3年复发42例，复发率是35.8% (42/117)。而复发者中SLC7A11的阳性表达和Ki-67阳性表达见表2。在117例喉癌患者中，术后5年内患者死亡为12例，生存为105例，其生存率为89.8%(105/117)，其中死亡者和生存者的SLC7A11和Ki-67阳性表达见表3，说明生存者与死亡者者的表达阳性率差别无统计学意义(P>0.05)。

表3 5年死亡者及生存者SLC7A11和Ki-67表达情况

3 讨 论

喉癌是来源于喉腔黏膜上皮组织的恶性肿瘤，其恶性程度及预后主要从细胞组织学分级、临床病理分型以及是否有淋巴转移等病理参数几方面评定[6]。胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(System Xc--)是由一条重链4F2hc(SLC3A2)和一条轻链xCT(SLC7A11)构成。重链SLC3A2负责几种氨基酸运输系统, 而轻链SLC7A11是只负责胱氨酸/谷氨酸转运，使胱氨酸转入细胞内并按照1∶1的比率将谷氨酸转出。细胞内胱氨酸(cystine)的摄取为谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成提供原料，GSH作为体内主要的抗氧化剂，在对抗氧化应激对机体的毒性反应中发挥重要的作用。而SLC7A11蛋白通过促进胱氨酸汲取以及谷胱甘肽生物合成，使机体免受氧化应激和铁细胞死亡反应[7]。如前所述，SLC7A11(xCT)是一种N-和C-末端位于细胞质内的12通道跨膜蛋白，其同单跨膜蛋白SLC3A2组成不依赖钠的胱氨酸和谷氨酸的电中性转运体系统Xc，据研究在多种恶性肿瘤中广泛存在[8，9]。对肿瘤细胞微环境进行特异性调控是这些转运蛋白的一个重要生物学特性，进而导致肿瘤及癌细胞较正常细胞的优势生长。有研究表明SLC7A11许多恶性肿瘤中呈过度表达，且与不良预后相关,作为诊断的生物标志物。Robert SM等[10]报道SLC7A11过度表达促进肿瘤增长,影响肿瘤患者的总体生存率。Guo等[11]证明SLC7A11在肝细胞癌(HCC)中明显增高,与肝癌患者的不良预后直接有关。而本研究结果显示，SLC7A11在喉癌组织中高表达，声带息肉中的表达水平相比，具有显著性差异(P<0.05)，并其阳性表达与临床分期有关，T3、T4分期组织中的高表达与在T1、T2分期的表达有显著性的差异(P<0.05)，与淋巴结转移、远处转移、组织分化程度无关。SLC7A11阳性表达在复发患者中明显高于未复发者，而在死亡者与生存者中的表达差异无统计学意义，因此可表明SLC7A11能促进喉鳞状细胞癌的发生、发展，但可能在患者生存时间上影响不大。

Ki-67是一种与细胞周期相关的增殖细胞核蛋白，是增殖性细胞核的标记物，代表着细胞增殖水平，能较好地反映恶性肿瘤的增殖状态，能广泛用于常规病理研究。既往研究中，Ki-67蛋白的准确表达、调控及分布，是细胞增殖、完成细胞周期生长不可缺少的，是检测肿瘤细胞增殖强弱的标志物，与多种癌症的发展、转移、预后等方面均有关联，是肿瘤预后评估的经典指标。Wang SJ[12]建议Ki-67不但可以预测胰腺神经内分泌肿瘤(PNENs)的预后,它针对该类患者还可以作为衡量患者接受手术或非手术治疗的一个重要的参数。Bieging KT[13]证明在食管鳞状细胞癌SLC7A11阳性表达与Ki-67指数呈明显正相关。本研究表明Ki-67的阳性表达与喉癌的临床分期和T分期有密切相关，本研究中临床分期愈晚，Ki-67阳性表达愈高，与年龄、性别、远处转移、组织分化程度、淋巴结转移无关。Ki-67阳性表达方面复发者明显高于未复发者，并差异有统计学意义，但在死亡患者与生存者中的表达无统计学差异。因此，表明Ki-67对喉癌的复发有影响，但对患者的生存率影响不大。

综上所述，在喉癌组织中SLC7A11高表达、Ki-67高表达，对喉癌术后复发有高危预警的作用。在喉癌组织中SLC7A11表达与Ki-67表达密切相关,且SLC7A11阳性表达结合Ki-67阳性表达预示喉癌患者术后预后不良。二者表达变化与患者术后复发有关，与术后生存时间关系不大，对评估患者预后有重要意义。