郭怡，杨璇，肖萍,2,通信作者

响应面法优化藜麦多糖提取工艺条件

郭怡1，杨璇1，肖萍1,2,通信作者

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300392）

本文分别采用水提取法、纤维素酶提取法、超声提取法3种方法，以藜麦多糖的提取率为考察指标，对红、白、黑3种颜色藜麦进行多糖提取。通过分析可知，采用纤维素酶提取法对3种颜色藜麦中的多糖进行提取的提取率均为最高，其中，白色藜麦多糖提取率最高，为6.8%，其次是红藜麦和黑藜麦，提取率分别为6.4%和5.9%；在此基础上，以白藜麦作为提取原料，采用单因素和Box-Behnken试验对提取料液比、加酶量、提取温度、提取时间进行优化，确定白藜麦多糖最优提取工艺条件为：料液比1∶32 g/mL，加酶量2 000 U/g，提取温度65 ℃，浸提时间90 min，在此条件下藜麦多糖提取率为8.0%。

藜麦；多糖；纤维素酶提取法；Box-Behnken试验

藜麦（Chenopodium quinoa Willd）是一种起源于南美洲安第斯山脉的古老伪谷物，近二十年来引起了世界各国广泛关注[1]。藜麦中蛋白质的含量为14%～22%，且含有8种人体必需氨基酸，此外还含有多种B族维生素、维生素E、钙、镁、钾、硒等营养物质，其中钙含量为874 mg/kg，铁含量为81 mg/kg，其钙、铁含量均显著高于大多数常用谷物[2-3]。因此，藜麦也被认为是“全球十大营养食品”之一[4]。藜麦作为未来最具潜力的农作物之一，含有丰富的黄酮、多酚、多糖、不饱和脂肪酸等营养功能因子，具有抗氧化、降血脂、增强免疫等生理功效，能够降低一些慢性疾病的发生风险[5]。藜麦的高营养价值和功能特性已成为国内外食品研究领域的热点，随着人们对藜麦研究不断深入，关于藜麦生物活性的报道数量也日益增多。

多糖类化合物是构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于动植物细胞中，是由醛基和酮基通过糖苷键连接的高分子聚合物[6]。近年来，从植物中提取多糖已得到广泛研究[7]，如莫晓宁等[8]关于枸杞多糖的提取研究，杨文丽等[9]对纳豆多糖理化性质的分析，HU等[10]关于川芎多糖的超声提取、抗氧化及抗癌活性的研究等。对于藜麦多糖的报道也有少许，袁俊杰等[6]使用水浴加热回流法提取藜麦种子多糖，通过单因素试验与响应面分析法对藜麦多糖的提取工艺进行优化，得到藜麦多糖得率可达15.81 g/100g；徐澜等[11]采用单一超声辅助提取藜麦种子多糖，提取率为2 mg/g；李佳妮等[12]利用酶具有用量少而催化效率高的特点，采用超声波法与酶法联合法对藜麦种子多糖提取工艺进行了研究，经酶法辅助超声波法提取比单一采用超声波法提取，多糖提取率增加1.5倍；HU等[13]从藜麦中分离出一种新的多糖（CQP），研究其对人肝癌SMMC 7721和乳腺癌MCF-7细胞的抗癌作用。本文主要采用水提取法、酶提取法、超声波提取法3种方法，对红、白、黑3种颜色藜麦米进行多糖提取，以藜麦多糖的提取率为考察指标，初步选定最佳提取原料和方法；在此基础上利用单因素和Box-Behnken试验，确定藜麦多糖最优提取工艺，以期为藜麦的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与设备

1.1 材料

藜麦（金昌西域神话食品有限公司）；纤维素酶（10 000 U/g，天津市诺奥科技发展有限公司）；葡萄糖、苯酚、硫酸、柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、95%乙醇均为分析纯。

1.2 试验仪器

AX224ZH电子天平（美国奥豪斯）；HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）；STARTER3100 pH计（美国奥豪斯）；KPB-V1358搅拌机（深圳市康佳电器有限公司）；LGR20-W高速冷冻离心机（北京京立离心机有限公司）；V-1200紫外可见分光光度计（上海沪粤明科学仪器有限公司）。

2 试验方法

2.1 藜麦预处理

分别挑选颗粒饱满的红、白、黑色藜麦米，粉碎后过80目筛，密封备用。

2.2 水提取法提取藜麦多糖

取粉碎后的红色、白色、黑色藜麦粉，按料液比1∶25 g/mL加去离子水，60 ℃条件下，水浴搅拌提取4 h，取样品于3 620 g离心10 min得上清液和沉淀。取上清液，加入4倍体积的 95%乙醇，4 ℃静置一夜，醇沉液3 620 g离心10 min，取沉淀溶于去离子水，利用苯酚-硫酸法测定多糖含量并计算藜麦多糖提取率。

2.3 纤维素酶提取法提取藜麦多糖

取粉碎后的红、白、黑色藜麦粉，按料液比1∶25 g/mL的比例加入pH为4.5的0.05 moL/L柠檬 酸-柠檬酸钠缓冲溶液，而后加入纤维素酶1 000 U/g（加酶量/藜麦干重），控制温度60 ℃，水浴搅拌后提取90 min，用氢氧化钠调节pH至中性，随后迅速提高温度至85 ℃，水浴反应2 h后于3 620 g离心10 min得上清液和沉淀。取上清液，加入4倍体积的95%乙醇，4 ℃静置一夜，醇沉液3 620 g离心10 min，取沉淀溶于去离子水中，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量并计算藜麦多糖提取率。

2.4 超声波提取法提取藜麦多糖

取粉碎后的红、白、黑色藜麦粉，按料液比1∶25 g/mL加去离子水，60 ℃条件下，超声浸提40 min，3 620 g离心10 min得上清液和沉淀。取上清液，加入4倍体积的95%乙醇，4 ℃静置一夜，醇沉液在3 620 g离心机中离心10 min，取沉淀，溶于去离子水中，利用苯酚-硫酸法测定多糖含量并计算藜麦多糖提取率。

2.5 白藜麦酶提取法单因素试验

2.5.1 不同料液比对多糖提取率的影响

分别选择1∶15、1∶25、1∶35、1∶45与 1∶55 g/mL料液比，加入pH为4.5的0.05 moL/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，加入纤维素酶1 000 U/g，60 ℃水浴搅拌90 min后用氢氧化钠调节pH至中性，随后迅速提高温度至85 ℃，水浴反应 2 h，3 620 g离心10 min得上清液。将离心后的上清液加入4倍体积的 95%乙醇中，4 ℃静置过夜，醇沉样品3 620 g离心10 min，取沉淀，溶解于去离子水，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量并计算藜麦多糖提取率。

2.5.2 不同加酶量对多糖提取率的影响

按料液比1∶25 g/mL，加入pH为4.5的0.05 moL/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，分别选择酶活力为1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 U/g的纤维素酶，60 ℃水浴搅拌90 min后用氢氧化钠调节pH至中性，随后迅速提高温度至85 ℃，水浴反应2 h。提取计算步骤如2.5.1中所述。

2.5.3 不同浸提温度对多糖提取率的影响

按料液比1∶25 g/mL，加入pH为4.5的0.05 moL/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，加入纤维素酶 1 000 U/g，分别选择浸提温度为40、50、60、70、80 ℃，水浴搅拌90 min后用氢氧化钠调节pH至中性，随后迅速提高温度至85 ℃，水浴反应2 h。提取计算步骤如2.5.1中所述。

2.5.4 不同提取时间对多糖提取率的影响

按料液比1∶25 g/mL，加入pH为4.5的0.05 moL/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，加入纤维素酶 1 000 U/g，保温60 ℃，水浴浸提时间分别为70、80、90、100、110 min，后用氢氧化钠调节pH至中性，随后迅速提高温度至85 ℃，水浴反应2 h。提取计算步骤如2.5.1中所述。

2.6 Box-Behnken试验设计

根据单因素试验结果，利用Box-Behnken试验设计对料液比、加酶量、提取温度、浸提时间进行优化，试验设计见表1。

表1 Box-Behnken试验设计表

2.7 藜麦多糖提取率的计算

3 结果与分析

3.1 不同提取方法对3种藜麦提取率的影响

根据提取方法的不同，由图1可看出，对3种藜麦提取率最高的方法是酶提取法，其中白色藜麦酶提取法提取率最高，其次是红色藜麦，最后是黑色藜麦；水提取法中3种藜麦提取率分别为，白色藜麦最高，其次是红色藜麦，最后是黑色藜麦；在超声提取法中，提取率为红色藜麦＞黑色藜麦＞白色藜麦。因此在后续试验中选择白色藜麦作为提取原料，采用纤维素酶提取法进行多糖的提取并对其工艺条件进行优化。

图1 不同提取方法对3种藜麦提取率的影响

3.2 白藜麦酶提取法单因素试验影响

3.2.1 不同料液比对白藜麦提取率的影响

如图2所示，采用1∶35 g/mL为最佳提取料液比，当料液比增加至1∶45 g/mL时，其多糖提取率显著下降。这是因为在一定料液比范围内，增加提取溶剂使用量有利于多糖的溶出，提取率增加；但若继续增加溶剂的体积，则相对减少底物浓度，酶促反应速度降低，出现多糖提取率下降的趋势[14]。

图2 不同料液比对白藜麦提取率的影响

3.2.2 不同加酶量对白藜麦提取率的影响

由图3可知，随着加酶量的增高，酶与底物反应更加充分，使得提取率呈增加趋势，在2 500 U/g时达到最高，提取率为7.0%。但随着加酶量进一步增加，浓度超过一定范围，酶就成了抑制剂，对反应有一定的抑制效果[12]。因此采用2 500 U/g为最佳加酶量。

图3 不同加酶量对白藜麦提取率的影响

3.2.3 不同浸提温度对白藜麦提取率的影响

如图4所示，藜麦多糖提取率随着温度的升高，呈先升高后降低的趋势，在温度达70 ℃时最高，提取率为7.0%，其原因是温度过高会抑制酶的活力，甚至会造成酶失活，导致提取率下降，因此选择最佳提取温度为70 ℃。

图4 不同浸提温度对白藜麦提取率的影响

3.2.4 不同提取时间对白藜麦提取率的影响

由图5可知，随着时间的增长，多糖提取率增高，当时间达到90 min时，提取率最高，为6.5%，其原因应该是多糖在固定时间段内会逐步析出，在此时间段内，多糖提取率会随时间的延长而增加。但如果超出这个时间段，多糖析出速率会小于多糖降解速率，这时会表现为提取率的逐渐减少[15]。因此选择90 min为最佳提取时间。

图5 不同浸提时间对白藜麦提取率的影响

3.3 响应面法优化藜麦多糖提取工艺

3.3.1 Box-Behnken试验设计

响应面优化法是通过一定的试验设计考察自变量，即影响因素对效应的作用并对其进行优化的方法，常用的有星点设计法（central composite design，CCD）、Box-Behnken Design（BBD）法等。Box-Behnken设计是一种基于3水平2阶的试验设计方法，采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数。该方法与CCD法相比，试验次数较少、成本低、试验精度高、且可弥补正交试验无法找到整个区域内因素最佳组合和最优响应值的缺陷、回归方程预测性良好，是解决实际问题的有效手段[16]。因此，本文根据单因素试验结果和Box-Behnken试验设计原理，选取料液比（1）、加酶量（2）、温度（3）、时间（4）4个因素对提取工艺进行优化，试验结果见表2。

表2 中心试验设计及试验结果

3.3.2 响应面模型建立及方差分析

使用Design-Expert 8.0软件进行二次响应面回归分析，得到下列多元二次响应面回归模型，回归方程为：

＝127.452 08＋0.355 831－0.033 1672－4.398 333＋1.430 004－7.416 67×10-312＋9.000 00×10-612－3.000 000×10-312＋2.100 0×10-314－1.666 67×10-822＋4.400 00×10-423－5.000 00× 10-624＋0.026 83332－4.100 0×10-342

由回归模型的方差分析（表3）可知，在本试验中，模型＜0.01具有极显著性，表明模型具有统计学意义；失拟因素值为0.388 7，不显著，说明该模型与实际值情况拟合较好，误差小。由表3可知自变量4具有显著性（＜0.05），自变量1、23、12、32、42具有极显著性（＜0.01）。进一步分析试验结果，各因素对藜麦多糖得率的影响从大到小依次为：料液比1＞时间4＞温度3＞加酶量2。

表3 回归模型方差分析

注：*表示在＝0.05水平上显著，* *表示在＝0.01水平上极显著

为了更加直观地表现出4个因素对藜麦多糖提取率的影响。绘制了对多糖提取率影响的2因素2水平响应立体图，如图7-12所示。

图7 料液比、加酶量对多糖提取率的影响

图8 料液比、温度对多糖提取率的影响

图9 料液比、时间对多糖提取率的影响

图10 温度、加酶量对多糖提取率的影响

图11 加酶量、时间对多糖提取率的影响

图12 温度、时间对多糖提取率的影响

经Box-Benhnken试验设计优化后得到藜麦多糖最优提取工艺条件为，料液比为1∶32 g/mL、加酶量为2 000 U/g、提取温度为65 ℃，浸提时间为90 min，按照优化后的条件试验得到白藜麦多糖提取率为8.0%。

4 结论

本论文采用水提取法、酶提取法、超声波提取法3种方法，以藜麦多糖提取率为考察指标，分别对红、白、黑3种颜色的藜麦进行多糖提取，通过试验得出白色藜麦多糖提取率最高。在此基础上，对白藜麦酶提取法进行料液比、加酶量、提取温度、浸提时间的单因素试验，结果表明，料液比为1∶35 g/mL、加酶量为2 500 U/g、提取温度为70 ℃、浸提时间为90 min时，藜麦多糖提取率最高；进一步利用Box-Behnken试验，确定白藜麦酶提取法的最优工艺为料液比1∶32 g/mL、加酶量2 000 U/g、提取温度65 ℃、浸提时间90 min，此时藜麦多糖提取率可达8.0%。

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Study on extraction process of quinoa polysaccharide by response surface methodogy

Guo Yi1, Yang Xuan1, Xiao Ping1,2,Corresponding Author

（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300392, China）

In this study, quinoa polysaccharide was extracted by water extraction method, cellulase extraction method and ultrasonic extraction method using the red color quinoa, white color quinoa and black color quinoa as materialwith the extraction rate of quinoa polysaccharide as an inspection index. The results showed that the highest extraction rate of polysaccharide was 6.8% with white quinoa through the enzyme extraction method, the red quinoa polysaccharide and black quinoa polysaccharide extraction rate were 6.4% and 5.9%, respectively. Furthermore, the single factor and Box-Behnken experiments were employed to optimize the cellulase extraction process for highest yield of white quinoa polysaccharides. The results suggested that the optimal extraction conditions were material-liquid ratio 1∶32 g/mL, the addition of cellulase 2 000 U/g, extraction temperature 65 ℃, and extraction time 90 min. Under the experiment conditions, the yield of polysaccharide was 8.0%.

quinoa; polysaccharide; cellulase enzyme extraction; Box-Behnken test

1008-5394（2020）04-0043-06

10.19640/j.cnki.jtau.2020.04.009

TS201.1

A

2019-09-12

郭怡（1996—），女，硕士在读，主要从事功能多糖与肠道菌群研究。E-mail：1076348079@qq.com。

肖萍（1986—），女，讲师，博士，主要从事功能多糖与肠道菌群研究。E-mail：xiaoping19860724@126.com。

责任编辑：张爱婷