高 摇 范振磊 林 杰 曾 仲 黄汉飞

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)可由脓毒血症、烧伤、严重创伤、外科手术和肾毒性药物引起。流行病学的调查和研究[1]显示，AKI的发病率达6.7%，病死率达23%；而在ICU中，AKI的发病率达22%，病死率高达48%。虽然，许多药物能够减轻AKI,但目前还没有药物能够有效治疗AKI，以保护肾脏。肾脏替代治疗仍然是AKI的主要治疗措施[1]。因此，如何保护肾功能仍然是临床上亟须解决的难题。

研究[2]证实，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)通过旁分泌方式分泌外泌体来作用于周围肾脏细胞，引起成熟肾脏细胞的去分化过程，使肾脏细胞增殖，从而发挥对肾脏的保护作用。外泌体的来源广泛，除了MSC能分泌外泌体外，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)和肾小管上皮细胞也能够分泌外泌体，通过作用于受体细胞介导保护作用[3-4]。外泌体能够内化于受体细胞，释放核酸分子和活性蛋白作用于受体肾脏细胞，介导对肾脏的保护作用。现就多种细胞来源的外泌体对肾脏缺血再灌注损伤(reperfusion-induced renal injury，RIRI)的保护作用之研究进行综述，以期为RIRI的治疗提供新思路。

1 外泌体的生物合成和生物学特征

不同来源的细胞均可产生外泌体，且形成机制基本相同：细胞质膜内陷形成早期核内体(endosomes)，早期核内体与高尔基复合体相互作用，逐渐成熟为晚期核内体，晚期核内体限制性质膜结构进一步以逆出芽的方式形成含有大量小泡聚集的多囊泡胞内体(MVB)。在此过程中，细胞质内活性蛋白因子、微RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)逐渐整合到外泌体或MVB内，MVB可与溶酶体结合，导致自身的降解，也可进一步与其来源的细胞质膜融合，以细胞胞吐的方式分泌外泌体和活性因子于细胞外环境，调节供体、临近细胞和远处组织的生物学功能[5]。在电子显微镜下，外泌体呈杯口状，直径40～200 nm,密度为1.13～1.18 g/mL[6]。脂质组学分析发现，外泌体富含胆固醇、神经酰胺、甘油磷脂，以及长而饱和的脂肪酰基链，可使外泌体具有稳定的双分子磷脂结构，避免其内部活性成分失活，还能增强外泌体的疏水性和亲脂性，使其容易通过生物屏障而被受体细胞摄取[7]。外泌体的内部组分复杂，已被证实的成分包括组织相容性复合物(MCH)Ⅰ、组织相容性复合物(MCH)Ⅱ、四分子交联体蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、程序性死亡蛋白(Alix)6、肿瘤易感基因蛋白(TSG)101、鸟苷酸三磷酸酶(Rabs)、膜联蛋白、热休克蛋白、细胞骨架蛋白和核酸分子(miRNA、mRNA)[8-9]。其中，四分子交联体蛋白、Alix6和TSG101常用于鉴别外泌体[10]。外泌体可存在尿液、血液、唾液、母乳和渗出液中，通过检测体液中外泌体的组分可协助疾病诊断[8]，具有潜在的临床应用价值。

2 不同来源外泌体与RIRI

2.1 MSC来源外泌体(MSC-exo)介导的肾脏保护作用 MSC-exo通过递送相应的活性蛋白因子和核酸分子至受体细胞内，激活肾脏细胞内的保护机制。MSC-exo及其供体组分的复杂性可能是该外泌体能通过多种机制保护肾脏的基础[11-13]。虽然，该外泌体对肾脏的保护作用是综合性的，但外泌体内活性蛋白因子和核酸分子的作用机制仍有待进一步研究来揭示。Lin等[14]的研究证实，MSC-exo通过抑制肾脏纤维化、炎性反应和氧化应激反应，降低细胞凋亡水平和促进血管再生，从而介导外泌体对RIRI的综合性保护作用。但这两种生物学过程介导肾脏保护作用的具体机制并没有被进一步阐明。Zhou等[15]的研究发现，MSC-exo通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路介导减轻肾脏氧化应激的作用，通过激活细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路介导肾小管上皮细胞增殖作用，同时上调抗凋亡蛋白(Bcl-2)和下调促凋亡蛋白(Bax)的表达，以促进外泌体对肾脏的综合性保护作用。而Bruno等[16]的研究发现，MSC-exo抑制肾小管上皮的细胞凋亡机制可能与外泌体可同时上调抗凋亡基因(bcl-xL、bcl2、BIRC8)和下调促凋亡基因(casp1、casp8、LTA)的表达有关。Zhang等[17]的研究发现，外泌体介导抑制氧化应激反应的可能机制是抑制了还原型辅酶Ⅱ氧化酶(NOX)2的表达，以减少活性氧(ROS)的产生。另有研究[18]发现，MSC-exo可通过激活Kelch样ECH相关蛋白(Keap)1/红细胞系衍生的核因子(Nrf)2相关因子/抗氧化反应元件(ARE)抗氧化应激信号通路，上调血红素氧合酶(HO)1的表达，减轻肾小管氧化应激损伤导致的凋亡和炎性反应。Zou等[19]的研究发现MSC-exo主要通过降低化学趋化因子(CX3CL1)的表达水平，抑制巨噬细胞介导的促炎性反应。Wang等[20]的研究发现MSC-exo抑制肾小管上皮细胞的凋亡和炎性反应的机制，主要与外泌体可诱导雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路活性的上调，进一步激活自噬途径介导的肾脏保护作用有关。综上，外泌体主要通过抑制氧化应激和炎性反应，以及降低细胞凋亡水平，介导对RIRI的综合性保护作用。

2.1.1 MSC-exo的活性蛋白介导的肾脏保护作用 研究[2,7,21-22]证实，MSC能通过旁分泌的方式分泌活性蛋白因子作用于受体肾脏细胞，虽然MSC分泌的活性因子对肾脏细胞的保护作用比较局限，但外泌体内的活性蛋白因子对肾脏的保护作用却很明显，外泌体具有的稳定脂质双层结构，可使其内部活性蛋白因子的活性不受细胞微环境的影响，而细胞微环境则可能影响MSC分泌的活性蛋白因子的活性。上述研究结论提示MSC-exo的活性蛋白能够激活受体肾脏细胞的保护机制，减轻RIRI。Wang等[20]的研究结果显示MSC-exo通过上调受体细胞内微管关联蛋白(LC3B)的表达，激活受体细胞内的自噬保护机制，减轻RIRI；但该研究对外泌体内发挥调控作用的蛋白因子没有阐明。Jia等[23]的研究发现MSC-exo能够激活受体肾脏细胞的自噬保护机制，且该机制与MSC-exo内14-3-3ζ蛋白有关，其可靶向调节自噬相关蛋白(ATG)16L的表达，增强自噬机制对肾脏的保护作用。Shen等[24]的研究发现MSC-exo能通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞介导的炎性反应对肾脏的损伤，这种保护作用主要与MSC-exo表达的化学趋化因子受体(CCR)2有关，其可结合肾脏组织中游离的化学趋化因子(CCL)2，降低组织中CCL2的水平，抑制炎症细胞的浸润，从而介导对肾脏的保护作用。Yuan等[25]的研究发现MSC-exo内特异性蛋白(SP)1也能通过抑制炎性反应介导对肾脏的保护作用，但这种保护作用是间接地通过抑制肾脏细胞的坏死性凋亡来实现的；MSC-exo通过递送SP1于受体肾小管细胞内，上调受体细胞内SP1的水平，激活肾小管上皮内鞘氨醇激酶信号通路(SP1/SK1/S1P)，减轻肾小管上皮细胞坏死性凋亡，抑制由损伤相关的分子模式(DAMP)激活的固有免疫反应。Zou等[26]的研究证实，MSC-exo能将血管内皮生长因子(VEGF)递送至受体肾小管上皮细胞内，可促进肾脏细胞的增殖和血管再生，而具体的机制未得到进一步揭示。Ju等[27]的研究证实MSC-exo对肾脏细胞的增殖作用是基于MSC-exo含有的肝细胞生长因子(HGF)，其可重新启动成熟的肾小管上皮细胞的去分化过程，还能激活肾小管细胞内ERK1/2信号通路，介导肾小管上皮的增殖。

2.1.2 MSC-exo相关的核酸分子介导的肾脏保护作用 研究[3, 26, 28-30]显示，提前用核糖核酸酶(RNase)预处理外泌体可有效抑制外泌体对受体肾脏细胞的保护作用，提示外泌体内miRNA或mRNA可能是介导肾脏保护作用的主要物质。MSC-exo的核酸分子能够靶向调节受体肾脏细胞内基因和蛋白的表达，激活细胞内相应的保护机制。Wang等[31]的研究发现MSC-exo通过将miRNA-199a-5p递送至受体肾小管上皮细胞内，靶向抑制结合免疫球蛋白(BIP)的表达，减轻内质网应激导致的肾小管细胞凋亡，但这种保护作用只限于RIRI的早期阶段。Zhu等[32]的研究发现，MSC-exo通过将miRNA-199a-3p递送至受体肾小管上皮细胞内，靶向抑制信号素(Sema)3A表达，激活肾小管上皮内蛋白激酶B(AKT)和ERK信号通路，拮抗细胞凋亡。Gu等[33]的研究发现，MSC-exo通过上调受体肾小管上皮细胞内miRNA-30的水平，靶向抑制动力相关蛋白(DRP)1的表达，拮抗线粒体分裂介导的促细胞凋亡作用。Wang等[34]的研究发现，miRNA-let7c介导MSC-exo对肾脏的保护作用是通过抑制肾脏纤维化的形成来实现，MSC-exo通过递送miRNA-let7c于受体肾小管上皮细胞内，上调肾小管上皮细胞内miRNA-let7c的水平，靶向抑制转化生长因子(TGF)β1的表达，抑制TGFβ1下游信号通路激活介导的促肾脏纤维化反应。然而，也有研究结果显示，MSC-exo可以直接通过递送活性蛋白因子的mRNA介导对肾脏的保护作用，其过程并不需要miRNA的间接靶向调节作用。Choi等[35]的研究发现，MSC-exo介导的肾脏保护作用，主要与MSC-exo含有血管生长因子核酸分子(VEGF-A-mRNA)、胰岛素样生长因子核酸分子(IGF-mRNA)和成纤维细胞生长因子核酸分子(FGF-mRNA)有关，但并未阐明具体的作用机制，这可能与受体肾脏细胞活性因子的水平上调，细胞内增殖机制启动有关。Ju等[27]的研究也发现，MSC-exo通过直接递送肝细胞生长因子核酸分子(HGF-mRNA)于受体肾脏细胞，上调受体肾脏细胞内HGF的水平，激活细胞内ERK1/2信号通路介导的肾小管上皮细胞的增殖作用。研究[13]结果显示，MSC-exo主要含有23种miRNA,包括miRNA-1246、miRNA-23a-3p、miRNA-451a、miRNA-125b-5p、miRNA-199a-3p/199b-3p、miRNA-4454/7975、miRNA-21-5p、miRNA-100-5p、miRNA-29a-3p、miRNA-144-3p、miRNA-29b-3p、miRNA-22-3p、miRNA-630、miRNA-221-3p、miRNA-424-5p、miRNA-191-5p、miRNA-25-3p、miRNA-30a-3p、miRNA-376a-3p、miRNA-27b-3p、miRNA-let-7a-5p、miRNA-let-7b-5p和miRNA-let-7i-5p，可以靶向调节5 481种mRNA的表达，提示MSC-exo内的miRNA的对RIRI有保护作用，但仍有待进一步研究和阐明。

2.2 EPC来源的外泌体(EPC-exo)介导的肾脏保护作用 RIRI能够破坏血管内皮细胞结构的完整性，诱导内皮细胞表面黏附分子表达上调，促进炎症细胞浸润，低氧则加重肾小管上皮细胞的坏死与凋亡，促进肾脏纤维化的形成；提示改善内皮细胞的功能，可减轻RIRI[36]。研究[37]证实，EPC也是通过旁分泌的方式作用于受损的内皮细胞，促进血管内皮细胞的修复与再生。而EPC-exo在介导对肾脏的保护作用中，起着至关重要的作用。Cantaluppi等[3]的研究发现，EPC-exo抑制受体内皮细胞凋亡的作用是通过EPC-exo内miRNA-126和miRNA-296来介导的；该研究结果提示，当用miRNA-126和miRNA-296抑制剂预处理EPC-exo时，EPC-exo抗内皮细胞的凋亡作用能够被有效地抑制，说明EPC-exo内miRNA-126和miRNA-296表达上调能够抑制内皮细胞的凋亡，但并未阐明具体的作用机制。Vias等[38]的研究则发现，EPC-exo内miRNA-486-5P能够介导对肾脏的保护作用，EPC-exo通过递送miRNA-486-5P于受体内皮细胞，上调内皮细胞内miRNA-486-5P水平，靶向抑制磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)的表达,激活AKT信号介导抑制细胞凋亡的保护作用；然而Vias等[39]的进一步研究则发现，受体内皮细胞表达的基质细胞衍生因子(SDF)-1α和EPC-exo表达的化学趋化因子受体(CXCR)4能够增强EPC-exo的归巢和靶向调节作用，促进受体内皮细胞对EPC-exo的吸收。EPC-exo内部组分复杂，相应的活性蛋白因子与核酸分子对受体细胞的保护机制还有待进一步阐明。

2.3 肾小管上皮细胞(renal epithelial cell，REC)来源的外泌体(REC-exo)介导的肾脏保护作用 Dominguez等[4]的研究发现，REC-exo可通过抑制炎性反应和肾脏的纤维化，以及促进血管的修复，介导外泌体对RIRI的综合保护作用。RIRI能够代偿性启动REC的保护机制，增强自身的耐受性。REC可能也是通过旁分泌的方式分泌外泌体介导对肾脏的保护作用。研究[40]结果显示，REC-exo含有水孔蛋白(AQP)1，能够促进肾小管细胞的迁移，提示REC-exo中AQP1对肾脏可能具有潜在的保护作用。相关研究[11,39]结果表明，REC-exo含有693种活性蛋白，参与介导对肾脏的保护作用，经缺氧预处理的REC-exo能够发挥明显的保护作用，进一步研究发现经过缺氧预处理的REC-exo能够表达更高水平的细胞间黏附分子(ICAM)1，其可增强受体肾小管上皮细胞与REC-exo的黏附作用，促进肾小管上皮细胞内化REC-exo的作用。Chen等[41]的研究发现REC-exo也能通过抑制炎性反应介导对肾脏的保护作用，REC-exo通过上调受体肾小管上皮细胞内激活转录因子(ATF)3的水平，靶向抑制单核细胞趋化蛋白(MCP)1基因的表达，抑制炎症细胞的浸润，减轻RIRI,而这种保护作用则可能是外泌体内ATF3蛋白及其mRNA共同作用的结果。

3 总结与展望

外泌体介导的受体肾脏的保护作用基于外泌体含有大量的活性蛋白和核酸分子，而这些活性蛋白和核酸分子对肾脏的保护作用机制尚未得到完全揭示。外泌体来源广泛、安全性高、生物活性稳定，能够用于协助疾病的诊断、作为药物和基因靶向治疗疾病的载体，具有潜在的临床应用价值。外泌体的提取技术、提取量和提取纯度是制约其临床应用的主要因素，因此，除亟须研发经济且便捷的提取技术外，还需研究外泌体分泌的影响因素，以获取高质量的外泌体应用于临床。