信红梅，姚 琳，陆键萍,3，曲 梦，江艳华，李风铃，郭莹莹，王联珠,

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000）

鳕鱼是鳕形目（Gadiformes）鱼类的总称，属脊椎动物门（Vertebrata）、脊椎动物亚门（Vertebrata）、真骨鱼纲（Teleostei），是世界上最重要的底层鱼类，也是国际水产品贸易中最主要的品种之一，具有较高的营养价值和经济价值[1-2]。目前，市场上常见的鳕形目鱼类主要有大西洋鳕（Gadus morhua）、太平洋鳕（G. macrocephalus）、狭鳕（G. chalcogrammus）、细鳞壮鳕（Albatrossia pectoralis）、黑线鳕（Melanogrammus aeglefinus）和阿根廷无须鳕（Merluccius hubbsi）等。此外，市场上还包含一些商品名中带“鳕”字，但在分类学上与鳕鱼毫无关联但价格很高的品种，如裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）（银鳕鱼、黑鳕）、小鳞犬牙南极鱼（Dissostichus eleginoides）和莫氏犬牙南极鱼（Dissostichus mawsoni）（白鳕鱼）[3-4]。学名与商品名的不统一，加之高值鳕鱼多以鱼块、鱼段和鱼片的形式销售，失去了可供鉴别的外部形态特征，导致命名混乱、以次充好、以假冒真的现象屡屡出现。“油鱼”体型较大，肉质白皙，切块后与高值鳕鱼鱼块外形十分相似，成为假冒高值鳕鱼的最主要品种。

“油鱼”是异鳞蛇鲭（Lepidocybium flavobrunneum）和棘鳞蛇鲭（Ruvettus pretiosus）的俗称，这两种鱼同属于鲈形目的蛇鲭科（Gempylidae），分别是异鳞蛇鲭属和棘鳞蛇鲭属的唯一种[5]，分布于热带及亚热带海域，脂肪含量极高，其中90%为C32～C36的蜡酯[6]。该蜡酯并不被人体消化、吸收，而是蓄积在直肠内，引起腹痛、恶心、呕吐和胃肠痉挛等症状，严重者导致油性腹泻，虽不足以致命，但对婴幼儿、胃肠敏感人群及孕期妇女具有较高 风险[5-6]。此外，“油鱼”中含有大量的组氨酸，若运输、保存条件不当，组氨酸会转化成组胺，食用后严重者会危及生命[7]。

“以油充鳕”现象不仅在我国，在美国[8]、加拿大[7]、 澳大利亚[6,9]等各国均有过类似报道，不仅扰乱了市场经济秩序，而且带来不可忽视的食品安全风险。日本、韩国和意大利等国已经禁止销售和进口“油鱼”[10]；美国、加拿大、澳大利亚和欧盟部分成员国等要求销售“油鱼”时必须加上适当标签[5]；我国除香港地区出台了《有关识别及标签：油鱼/鳕鱼的指引》之外[4]，目前我国尚未对“油鱼”有禁止或限制食用的规定，这与缺乏与之配套的检测技术不无关系。针对“油鱼”，即异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭，建立物种特异性检测方法成为当务之急。

本研究针对异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的线粒体细胞色素C氧化酶I（cytochrome C oxidase subunit I，COI）基因序列，分别设计了两对物种特异性引物和探针，基于实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）建立了异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分的检测方法，以期为保护消费者权益、打击水产品掺杂使假提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻鳕鱼片（编号DXYP）、鳕鱼排（编号XYP）等50 份市售标称为“鳕鱼”的制品在本地超市、市场及餐饮店购得。

异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、黑线鳕、小鳞犬牙南极鱼、莫氏犬牙南极鱼、裸盖鱼、蓝鳕、绿青鳕、细鳞壮鳕、狭鳞庸鲽、阿根廷无须鳕、蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、大目金枪鱼、剑鱼、鲣鱼、鲈鱼、鲐鱼、大菱鲆、鲫鱼、草鱼、鳙鱼、鲤鱼、暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、旗鱼、鳜鱼、罗非鱼、鮟鱇鱼、鲢鱼、大黄鱼35 种实验样品由本室收集保存。

海洋动物组织DNA提取试剂盒 天根生化科技 （北京）有限公司；PremixExTaq（2×） 宝生物工程（大连）有限公司；引物与探针的合成及DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；Light Cycler 480实时荧光PCR仪 瑞士Hoffmann-La Roche有限公司；DK-8D电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；WH2微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；微量核酸蛋白测定仪 德国Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA制备

取30 mg鱼肉组织剪碎后置于1.5 mL离心管中，用海洋动物组织DNA提取试剂盒提取DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。用微量核酸蛋白测定仪测定DNA浓度和纯度，置于-20 ℃保存。

1.3.2 引物与探针的设计

表1 18 种鳕鱼及其易混品种COI基因的代表性序列Table 1 Representative sequences of COI genes of 18 cod species and other species commonly used as adulterants

图1 异鳞蛇鲭引物和探针位置图 Fig. 1 Positions of the primers and probes for L. flavobrunneum

根据我国进出口以及或消费环节的调研，选择异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、大西洋鳕、太平洋鳕、狭鳕、黑线鳕、小鳞犬牙南极鱼、莫氏犬牙南极鱼、裸盖鱼、蓝鳕、绿青鳕、细鳞壮鳕等18 个品种的“鳕鱼”及其易掺假品种，在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载其COI基因的代表性序列（表1），用DNAMAN 8.0和BioEdit7.0软件进行序列比对、输出，针对异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭的物种特异性片段分别设计上、下游引物与探针，引物、探针位置见图1、2，引物及探针序列见表2。

图2 棘鳞蛇鲭引物和探针位置图 Fig. 2 Positions of the primers and probes for R. pretiosus

表2 引物及探针序列Table 2 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.3 反应体系及条件

反应体系：PremixExTaq（2×）12.5 μL；上游引物、下游引物（10 μmol/L）各0.55 μL；探针（10 μmol/L） 0.3 μL；DNA模板5 μL，用无菌水补至总体系为25 μL。

反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 个循环，收集荧光信号，扩增曲线图及扩增效率图由real-time PCR仪的自带软件Light Cycler 480 SW1.5.1生成。

1.3.4 特异性分析

利用异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的引物、探针及检测方法，分别以异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、大西洋鳕、太平洋鳕、狭鳕、黑线鳕、小鳞犬牙南极鱼、莫氏犬牙南极鱼、裸盖鱼、蓝鳕、绿青鳕、细鳞壮鳕、狭鳞庸鲽、阿根廷无须鳕、金枪鱼等35 种样品DNA为模板，无菌水为空白对照，依照1.3.3节方法分别进行real-time PCR扩增，验证方法的特异性。

1.3.5 灵敏度分析

1.3.5.1 绝对灵敏度

将提取的异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭DNA模板原液（质量浓度20 ng/μL）用无菌水分别进行10 倍梯度稀释，即20、2、0.2、0.02、0.002、0.000 2 ng/μL和0.000 02 ng/μL 7 个质量浓度梯度，依照1.3.3节方法分别进行real-time PCR扩增，每个质量浓度设2 个平行。该实验重复3 次，利用软件SPSS 22.0计算Ct值的平均值、标准偏差和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5.2 相对灵敏度

将异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭肌肉组织分别与太平洋鳕肌肉组织以一定比例混合，制成异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭添加量分别为10%、5%、1%、0.1%、0.01%和0.001%的混合样品，提取DNA，依照1.3.3节方法分别进行real-time PCR扩增，每个含量设2 个平行。该实验重复3 次。

1.3.6 市售“鳕鱼”制品检测

利用本研究建立的方法对50 份市售“鳕鱼”制品进行检测，分析其中是否含有异鳞蛇鲭或棘鳞蛇鲭成分。样本的真实性成分按GB/T 35918—2018《动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法》进行分析[11]。

2 结果与分析

2.1 样品DNA

所有样品的DNA质量浓度在20～70 ng/μL之间，A260nm/A280nm在1.8～2.0之间，满足real-time PCR的要求。

2.2 特异性分析

基于异鳞蛇鲭特异性引物和探针建立的检测方法对供试的35 种鱼的DNA进行real-time PCR扩增，结果表明，该方法仅对异鳞蛇鲭有明显扩增，Ct平均值为16.50，呈典型的阳性结果，其他被测DNA及空白对照在40 个循环内没有扩增，呈典型的阴性结果（图3）。基于棘鳞蛇鲭特异性引物和探针建立的检测方法对供试的35 种鱼的DNA进行real-time PCR扩增，结果表明，该方法仅对棘鳞蛇鲭有明显扩增，Ct平均值为15.54，呈典型的阳性结果，其他被测DNA及空白对照在40 个循环内没有扩增，呈典型的阴性结果（图3）。说明异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的检测方法均具有良好的特异性。

图3 异鳞蛇鲭（A）和棘鳞蛇鲭（B）real-time PCR特异性分析Fig. 3 Specificity evaluation of real-time PCR for L. flavobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

2.3 灵敏度分析

2.3.1 绝对灵敏度

图4 异鳞蛇鲭（A）和棘鳞蛇鲭（B）real-time PCR绝对灵敏度Fig. 4 Absolute sensitivities of real-time PCR for L. flavobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

图5 异鳞蛇鲭（A）和棘鳞蛇鲭（B）real- time PCR扩增效率Fig. 5 Amplifciation effciiencies of real-time PCR for L. falvobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

将质量浓度20～0.000 02 ng/μL的异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭DNA分别进行real-time PCR扩增，扩增曲线如图4所示，扩增效率如图5所示，得到标准曲线的斜率分别为 -3.412和-3.324；相关系数R2分别为0.995 7和0.995 3；根据扩增效率公式（扩增效率/%＝（10（-1/斜率）-1）× 100））得到异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的扩增效率分别为96.38%、99.89%，均在可接受区间90%～110%内。

当异鳞蛇鲭DNA质量浓度为20～0.002 ng/μL时，均出现明显的扩增曲线，当其低于0.002 ng/μL，扩增曲线在基线位置，说明异鳞蛇鲭的检测方法灵敏度为0.002 ng/μL； 当 棘 鳞 蛇 鲭D N A 质 量 浓 度 为2 0 ～0.0 0 0 2 n g/μ L 时，出现明显的扩增曲线，当其低于0.000 2 ng/μL，扩增曲线在基线位置，说明棘鳞蛇鲭的检测方法灵敏度为0.000 2 ng/μL。

表3 real-time PCR重复性Table 3 Repeatability of the real-time PCR method

real-time PCR重复性见表3。随着异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭样品DNA含量降低，Ct值呈增高趋势，异鳞蛇鲭5 个质量浓度样品Ct值的标准偏差在0.10～0.74之间，RSD在0.61%～2.64%之间；棘鳞蛇鲭6 个质量浓度样品Ct值的标准偏差在0.31～0.76之间，RSD在1.42%～2.50%之间，均在可接受范围内。因此，本实验建立的 real-time PCR检测方法具有良好的重复性。

2.3.2 相对灵敏度

图6 异鳞蛇鲭（A）和棘鳞蛇鲭（B）real-time PCR相对灵敏度检测Fig. 6 Relative sensitivities of real-time PCR for L. flavobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

利用建立的方法分别检测混有不同质量比的异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭肌肉的太平洋鳕鱼肉，扩增结果如图6所示。当异鳞蛇鲭添加量在0.01%及以上时出现明显的扩增曲线，当添加量低于0.01%时，荧光扩增曲线在基线位置，说明异鳞蛇鲭real-time PCR的检测相对灵敏度为0.01%；当棘鳞蛇鲭添加量在0.01%及以上时出现明显的扩增曲线，当添加量低于0.01%时，荧光扩增曲线在基线位置，说明棘鳞蛇鲭real-time PCR的检测相对灵敏度也为0.01%。

2.4 市售“鳕鱼”制品检测结果

利用建立的real-time PCR法对50 份市售“鳕鱼”制品进行检测，结果发现在1 份标称“水鳕鱼”的样品中检测出异鳞蛇鲭成分，在1 份标称“水鳕鱼”的样品中检测出棘鳞蛇鲭成分，与标签不符，该结果与按GB/T 35918—2018的检测结果一致（表4）。

表4 市售“鳕鱼”制品中油鱼成分检测结果Table 4 Results of detection of R. pretiosus- and L. flavobrunneum- derived ingredients in commercial cod products

3 讨 论

近年来，“以油充鳕”现象频发，严重侵害了消费者的权益，扰乱了行业的的正常经营秩序，由此带来的食品安全风险不容忽视。建立一种准确、快速的“油鱼”检测方法已经成为研究热点。高值鳕鱼的捕捞加工方式，决定了该类产品主要以去头、去内脏、切段和切片的方式销售，缺乏传统的形态学鉴定所需的外部特征。因此多数研究者重点关注基于蛋白质、核酸等生物大分子的检测方法。

Ochiai等[12]基于蛋白质分子质量的不同，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技术对“油鱼”进行鉴别。该方法将异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、无须鳕及裸盖鱼等29 种鱼类的可溶性肌肉蛋白分别进行SDS-PAGE分析，得到具有“油鱼”物种特异性的蛋白指纹图谱，从而将“油鱼”与其他鱼区分开。该方法虽具有检测成本低、较准确的特点，但当鱼肉经过加热等环节后将导致部分特征性蛋白变性或降解，从而使原有的指纹图谱发生变化，导致出现假阴性的结果[13]，因此该方法仅能对新鲜样品进行鉴别。此外，该方法的灵敏度较低，对掺有“油鱼”的鱼肉混合样品进行鉴别的分辨率有限，也限制了该方法的实际应用。

此外，由于大型分析仪器的快速发展，色谱分析技术在食品安全检测方面的应用已较为广泛，成功实现了鲑鱼、鲟鱼和金枪鱼[14]等物种的鉴别，并呈现出高灵敏、高分辨等技术优势[15]。Ling等[7]利用蜡酯的极性低和热稳定性好的特点，通过气相色谱-质谱联用并结合薄层色谱技术分析异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、大西洋鳕和裸盖鱼等30 个鱼类样品中的蜡酯成分。结果表明仅在异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的样品中存在C32～C36的蜡酯特征峰，热处理样本与新鲜样本的分析结果一致，说明该方法可用于鉴定热加工后的样品。然而该类分析方法仪器成本较高，操作过程繁琐，标准化与推广应用前景均具有一定的局限性，一般不作为生物大分子靶标的首选检测和仲裁鉴定方法[16]。

DNA在动物不同组织器官中完全相同，其完整性受食品加工过程的影响较小等优点已成为物种鉴别的主要研究对象[16-18]。Park等[19]利用16S rRNA序列设计了两对特异性引物，通过PCR结合测序比对检测异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭成分，但该方法过程繁琐、耗时长，在PCR产物处理过程中容易造成污染从而产生假阳性的结果。Dalama等[10]利用线粒体COI基因设计了一组特异性引物和探针，通过多重real-time PCR的方法鉴定“油鱼”，该方法可以对异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的同时检测，无需PCR产物的后续处理等步骤。然而多重real-time PCR在扩增过程中各检测通道波长容易互相干扰导致扩增效率降低，易产生假阳性结果等缺陷。real-time PCR方法具有准确度和灵敏度高、可靠性和特异性强、重现性好、操作简便等优势[20-22]，目前已广泛应用于食品中鲑科鱼类[23]、转基因鲑鱼[24]以及大西洋鳕、太平洋鳕和狭鳕[25]等物种鉴别、食品原料掺假、成分检测等领域，显示了其良好的应用前景。

物种特异性基因片段的选择是real-time PCR法进行物种鉴别的关键。本研究在预实验中针对16S rRNA、COI和Cyt b等基因分别设计了异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭的物种特异性引物与探针，在验证了各个靶标的特异性后最终选定针对COI基因设计的特异性引物及探针。线粒体COI基因具有结构简单、相对保守、覆盖了更广泛的分类单元，进化速率和长度适中等优点，广泛用于海洋生物的的鉴定和分类[26]。许多学者将线粒体COI基因用于动物尤其是鱼类的鉴别研究中[27-30]。此外，COI基因还被成功应用于鉴别市场上出售的食用鱼片真伪[31]。

本研究建立的real-time PCR检测方法具有很好的重复性，最低可检出0.002 ng/μL（异鳞蛇鲭）和0.000 2 ng/μL （棘鳞蛇鲭）的目标DNA，与Dalama等[10]建立的多重real-time PCR方法检出限为0.003 ng/μL（异鳞蛇鲭）和0.004 ng/μL（棘鳞蛇鲭）相比具有一定优势。本研究还将异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭鱼肉与太平洋鳕鱼肉按不同比例混合，模拟掺杂使假的样本，评价检测方法的相对灵敏度。结果表明，两个方法相对灵敏度均可达0.01%，即在1 kg鱼肉中添加0.1 g异鳞蛇鲭或棘鳞蛇鲭鱼肉也可被本方法检测出来，说明该方法不仅可以检测鱼段、鱼片的原料是否为“油鱼”，而且可以检测鱼糜等制品中是否掺杂“油鱼”肉，显示了该方法具有良好的应用前景。此外，为了验证本方法的实用性，利用两种方法分别对50 份市售“鳕鱼”制品进行检测，有2 份样品分别检出了异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭的成分，并且检测结果与传统的测序结果一致，表明本方法具有良好的准确性及实际应用价值。同时也在一个侧面反映出，尽管主管部门不断加强监管，市面上仍有用“油鱼”假冒鳕鱼的情况，本方法为主管部门精准监管、精准执法，保护消费者权益，保障食品安全，维护水产行业的健康良性发展提供了可靠的技术支撑。