吴 宇，叶 金,*，李 丽，李 森，轩志宏，崔 华，刘洪美，王松雪,*，马海华，张 峰，何建洪

（1.国家粮食和物资储备局科学研究院粮油质量安全研究所，北京 102629；2.河南工业大学信息科学与工程学院，河南 郑州 450001；3.睿科仪器（厦门）有限公司，福建 厦门 361000）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是小麦和玉米等作物受到镰刀菌污染后产生的一种真菌毒素[1]，具有类雌激素作用，影响动物的繁殖功能[2]，具有免疫毒性和遗传毒性[3]，有潜在致癌性[4]。胡佳薇等[5]对陕西省10 个地市随机采集市售谷物及其制品、玉米油等进行检测，ZEN总检出率为17.27%，玉米油的检出率为79.37%，均值为149 μg/kg，谷物制品中有12 份样品超标，超标率为1.64%。Piacentini等[6]对巴西76 份酿造用大麦中ZEN含量进行检测，ZEN检出率为73.5%，检出值在 300～630 μg/kg。因此需要简单、高效、精确的检测方法对粮油中ZEN污染情况进行监测。

目前，食品中ZEN的检测方法有薄层色谱法[7-9]、酶联免疫吸附法[10-13]、气相色谱质谱法[14-18]、高效液相色谱法[19-23]、液相色谱-质谱联用法[24-31]。其中薄层色谱法由于精密度低、操作规程复杂耗时、分析结果重复性和再现性差，已经逐渐被其他仪器方法所取代。酶联免疫吸附法方便、快捷、灵敏度高，可以作为快检方法使用，但是容易产生假阳性。气相色谱法适用于挥发性强、热稳定性好的真菌毒素检测，ZEN不易挥发，需要在进入气相色谱柱前进行氮吹浓缩和衍生，步骤繁琐，因此在真菌毒素检测方面应用并不广泛。高效液相色谱法是真菌毒素检测中最常用的方法，特异性强、灵敏度高，但是容易受到干扰导致检测假阳性。液相色谱-质谱联用法可以提高分析的灵敏度和稳定性，具有分析速度快、抗干扰能力强等特点，能够避免假阳性准确高效进行定性定量检测，受到广泛使用。

本研究将免疫亲和柱净化步骤自动化，用全碳标记稳定同位素内标法定量校正加标回收率及仪器基质效应，超高效液相色谱-串联质谱法精确测定粮油中的ZEN。本方法无需氮吹、可批量自动化处理样品36 个，实现无人值守，提高工作效率，同时避免因人员操作导致的结果偏差，提高方法精密度；内标法定量校正加标回收率及仪器基质效应，提高方法准确性。可用于实验室能力比对及标物研制过程中的准确定值及均一性检验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；磷酸盐缓冲液盐包、吐温-20（色谱纯） 美国Sigma公司；超纯水 广州Waston公司；ZEN免疫亲和柱 中检维康公司；同位素内标13C18-ZEN（25 μg/mL） Romer国际贸易（北京）有限公司；甲醇ZEN（20.52 μg/mL， 国家标准物质GBW(E)100301）、玉米全粉ZEN（国家标准物质GBW(E)100385）、全麦粉ZEN（质控样品Wheat-ZEN-2018）、玉米油中ZEN（质控样品Corn Oil-ZEN-2018）、大米粉ZEN和黄曲霉毒素（质控样品RICE-ZEN&AFB1-2018）、糙米粉ZEN（质控样品Brown rice-ZEN-2018）、玉米全粉空白（质控样品Corn-Toxin-NK）、全麦粉空白（质控样品Wheat-Toxin-NK）、大米粉空白（质控样品Rice-Toxin-NK）、糙米粉空白（质控样品Brown rice-Toxin-NK）、玉米油空白（质控样品Corn oil-Toxin-NK） 国家粮食与物资储备局科学研究院。

1.2 仪器与设备

Fotector Plus全自动固相萃取仪 睿科仪器有限公司；Q-Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪 德国Thermo Fisher Scientific公司；3-30K离心机 美国Sigma公司；GT10-1高速台式离心机 北京时代北利离心机有限公司；多管涡旋振荡器 北京踏锦科技有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters Cortecs C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），柱温40 ℃；流动相A为甲醇，B为含体积分数0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸铵溶液，流速0.3 mL/min。 梯度洗脱条件：0 ～6 m i n，3 0%～5 0% A，7 0%～5 0% B；6 ～6.1 m i n，5 0%～9 5% A，50%～5% B；6.1～7 min，95% A，5% B；7～7.1 min，95%～30% A，5%～70% B；7.1～10 min，30% A，70% B。流速为0.2 mL/min，进样量为2 µL。

1.3.2 质谱条件

加热电喷雾离子源：温度300 ℃；毛细管电压3.2 kV；离子传输管温度320 ℃；鞘气35 unit；辅助气10 unit；Targeted-SIM模式；极性：正离子模式；扫描范围m/z250～800；分辨率70 000；自动增益控制5×105；最大驻留时间20 ms；同时扫描的母离子数5；质荷比宽度m/z1.5。

1.3.3 样品前处理

全自动固相萃取仪前处理法：准确称取（5±0.01）g 样品，加入20 mL 90%乙腈溶液，涡旋提取20 min，7 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液加入20 mL 0.1% PBST缓冲液，7 000 r/min离心5 min，取20 mL过滤液于全自动固相萃取仪的80 mL上样管内，运行编好的方法对样品进行自动净化（具体步骤详见表1，甲醇洗脱体积为2 mL），过膜上机检测。

表1 全自动固相萃取仪免疫亲和柱净化程序Table 1 Purification programs of automatic solid phase extraction apparatus with immunoaffinity columns

1.3.4 样品ZEN含量测定

准确移取ZEN标准储备液适量，用甲醇逐级稀释配制成不同质量浓度系列的标准工作液。分别吸取180 µL标准工作液，加入20 µL13C18-ZEN稳定同位素工作液于400 µL内插管中。将待测试样品溶液和标准工作曲线进行检测，得到ZEN及13C18-ZEN的峰面积，以标准溶液质量浓度为横坐标，以相应的ZEN与13C18-ZEN峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，由标准曲线得到试样溶液中ZEN质量浓度。试样中ZEN含量按下式计算：

式中：X为样品中ZEN含量/（μg/kg）；ρ为样品测定液中ZEN质量浓度/（ng/mL）；f为稀释因子8；m为试样的称样量/g。

2 结果与分析

2.1 上样流速优化

实验考察玉米基质加标稀释液在上样流速为2、4、6、8 mL/min时的柱回收率，结果如图1所示，流速为2～8 mL/min时，回收率在95.2%～101.0%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在1.7%～3.8%之间。因此选择8 mL/min的流速，即缩短上样时间，又保证回收率最佳。

图1 上样流速对ZEN回收率的影响Fig. 1 Effect of sample loading flow rate on ZEN recovery

2.2 气推次数的优化

淋洗之后，柱子内的残留液体是否推得干净是影响回收率的关键因素，因此优化淋洗之后的气推次数保证柱子吹干至关重要，结果如图2所示，以80 mL/min流速气推3 次后柱子质量不再变化，说明柱子吹干。

图2 气推次数对柱子吹干情况的影响Fig. 2 Effect of number of pushing cycles on column mass

2.3 洗脱体积准确性考察结果

用全自动固相萃取仪考察1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，接收洗脱液于10 mL离心管内扣紧盖子用精密天平进行称量，考察1 mL甲醇洗脱体积的准确性。结果表明1 mL甲醇洗脱体积平均值（n=6）为0.790 7 g，RSD值为1.7%，1 mL甲醇理论质量为0.79 g，因此可以用1 mL甲醇直接洗脱无需氮吹复溶。

2.4 方法线性、检出限及定量限

表2 外标法和内标法定量方法的线性、检出限和定量限比较Table 2 Comparison of linearity, LOD and LOQ between internal and external calibration methods

采用纯甲醇配制ZEN内标和外标标准曲线，并按照样品前处理方法对空白样品进行处理获得空白基质液，采用逐级稀释法获得ZEN的检出限（RSN≥3）和定量限（RSN≥10）。如表2所示，本研究建立的内标法定量方法的线性相关系数为0.999 5，检出限为0.33 μg/kg，定量限为1 μg/kg，RSD值为4.7%，均优于外标法定量方法。

2.5 日内精密度及回收率

分别采用本研究开发的内标方法与外标方法对配制的高、中、低3 个浓度梯度的玉米、小麦。大米、糙米、玉米油加标样品进行检测，结果见图3。本研究开发的内标定量方法回收率在92.7%～101.3%之间，RSD值在0.02%～3.74%范围内，外标法定量方法回收率在54.8%～76.4%之间，RSD值在0.5%～7.0%范围内。超高效液相色谱-串联质谱在离子化过程中容易受到基质干扰对目标化合物的响应有基质增加或者抑制效应。外标法由于没有进行基质效应的校正使得基质中的ZEN响应明显低于纯溶液标准品中的响应导致回收率偏低。而全碳标记的13C稳定同位素内标由于和目标化合物有相同的保留时间和离子化效率，因此能够有效校正基质效应，达到提高准确度和精密度的目的。因此内标法的回收率明显优于外标法。

图3 不同加标水平粮食样品的回收率Fig. 3 Recoveries of ZEN from different grains at different spike levels

2.6 日间精密度

采用本研究开发的内标方法对3 个样品连续4 d进行检测，结果见表3。本研究开发的内标定量方法日间精密度（RSD）在0.7%～4.1%范围内，重现性良好。

表3 新方法日间精密度Table 3 Inter-day precision of the new method

2.7 方法的准确性

表4 新方法对参考物质的测定结果（n=3）Table 4 Measured values for reference materials obtained by the new method (n= 3)

图4 玉米样品中ZEN（A）及13C18-ZEN（B）色谱图及质谱图（C）Fig. 4 Chromatograms and mass spectra of ZEN and 13C18-ZEN in corn samples

采用本研究开发的内标方法对质控样品进行测定。如表4所示，所有测定值均在标示值范围内。实际玉米样品中的色谱和质谱图见图4，ZEN与13C18-ZEN的保留时间一致，但是精确相对分子质量又相差18.060 52，表明通过内标可以协助ZEN的定性判定。

3 结 论

本研究开发的免疫亲和柱全自动净化-超高效液相色谱-串联质谱-全碳标记内标法精确测定粮油中的ZEN方法的检出限为0.33 μg/kg，定量限为1 μg/kg，相关系数为0.999 5，回收率在92.7%～101.3%，RSD值在0.02%～3.74%，测定3 种基体质控样品的结果均在标示值范围内，准确性和精密度明显优于外标定量方法。本实验方法与其他方法[32-34]相比无需氮吹、可批量自动化处理样品36 个，实现无人值守，提高工作效率，避免因人员操作导致的结果偏差，提高方法精确度；内标法定量校正加标回收率及仪器基质效应，提高方法准确性。可用于实验室能力比对及标物研制过程中的准确定值及均一性检验。